原创 秦力铮 等 中华口腔医学杂志
作者：秦力铮 靳路远 曲兴民 王松灵
摘要
绿叶蔬菜是饮食硝酸盐的主要来源，饮食硝酸盐由肠黏膜吸收入血。腮腺是机体转运硝酸盐的重要器官，唾液腺通过唾液腺浆液性细胞膜上硝酸盐转运蛋白（sialin）主动摄取血液中硝酸盐分泌至唾液。唾液硝酸盐在口腔细菌作用下部分还原为亚硝酸盐及一氧化氮，唾液硝酸盐和亚硝酸盐随吞咽及肠黏膜吸收再次进入循环。硝酸盐—亚硝酸盐—一氧化氮途径是体内一氧化氮非经典来源途径，其在生理和病理状态下发挥重要作用，尤其是在低氧和缺血状态下更明显。这些作用包括机体保护（如胃肠、心血管保护）、抗炎、调节糖脂代谢、提高运动能力、维持肠道菌群平衡及延缓衰老等。以往认为硝酸盐对机体有害的观点被证明缺乏科学依据。随着研究和应用的不断深入，硝酸盐作为从口腔走向全身的使者有望在全身健康及疾病防治中发挥重要作用。
硝酸盐（NO3-）是食物中的天然成分，以绿叶蔬菜含量最高，其次是加工肉类。此外，水、土壤中因地理环境不同也含有不同浓度硝酸盐。在20世纪，人们一直认为食物中的硝酸盐有害，主要原因是推断其可在体内还原为亚硝酸盐，亚硝酸盐与亚硝胺的形成及癌症的发生相关[1]。因此，人们对食物和饮用水中的硝酸盐含量进行严格限定，世界卫生组织建议每日硝酸盐摄入量为3.7 mg/kg。近20年来，人们对硝酸盐的认识发生了根本性转变。超过80%的食物硝酸盐来自蔬菜，而蔬菜通常被认为是健康食品。流行病学研究发现，绿叶蔬菜中的硝酸盐可以预防心血管疾病，而剥夺食物中的硝酸盐摄入可导致代谢性疾病和心血管疾病[2]。机体获得硝酸盐依赖两种途径：外源性摄入和内源性产生[3]。菠菜、莴苣和甜菜等绿色蔬菜可提供80%~90%的食物硝酸盐，加工肉类食物提供10%~15%。一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase，NOS）可利用L-精氨酸合成一氧化氮，一氧化氮在机体内的氧化终产物为硝酸盐。硝酸盐具有重要的生理功能和疾病防治潜能，口腔和唾液腺在硝酸盐代谢和功能发挥中起关键作用[1-3]。
一| 口腔在硝酸盐代谢和功能中的重要性
口腔是机体最具生态活力的环境之一，有500~1000亿个细菌，由近700个已鉴定的细菌物种组成[4]。舌后背部隐窝中的兼性厌氧菌可以还原唾液硝酸盐[5]。许多细菌在体外培养中能表达硝酸盐还原酶基因，并将硝酸盐还原为亚硝酸盐（NO2−）[6]。后者可抑制口腔内致病菌，起到调节口腔菌群的作用[7]。
口腔微生物稳态可能与心血管疾病有关。无论是健康志愿者还是治疗期高血压患者，连续使用氯己定漱口水7d，其血压均可增高[8-10]。硝酸盐可降低血压，如同时采用抗菌漱口水含漱，这种作用即可消失[11]。良好的口腔卫生有利于心血管健康，而牙周病可增加罹患心血管疾病的风险。但使用抗菌漱口水可影响正常口腔菌群，减低口腔细菌的硝酸盐还原能力，从而影响血压。哺乳动物缺乏自身的硝酸盐还原酶。口腔细菌和哺乳动物宿主之间似存在一种共生关系，如果口腔细菌功能被破坏，饮食硝酸盐对心血管的有利作用即消失。因此，定期使用抗菌漱口水与口腔菌群和全身健康的关系仍需深入研究。饮食提供的硝酸盐与NOS合成一氧化氮来源的硝酸盐可能存在差异，当摄入适量（约200 g/d）绿叶蔬菜时，饮食来源的硝酸盐占主导地位[12-13]。
体内25%的硝酸盐被唾液腺主动吸收，并分泌到唾液中至胃肠道[1-2]。唾液腺中主导硝酸盐转运的腺体一直不清楚，Xia等[14]通过小型猪建立腮腺萎缩模型，明确了腮腺是机体硝酸盐转运的主要器官。硝酸盐有益的生物学功能已被广泛认可，但硝酸盐如何进入细胞以及如何发挥作用一直不清楚。由笔者课题组牵头，经过长期研究基于唾液腺器官发现了细胞膜硝酸盐通道[15]。硝酸盐可诱发唾液腺细胞出现特异性胞膜电流，酸性环境下电流成倍增加，提示硝酸盐通过胞膜和质子协同进入细胞。通过基因检测和生物信息学分析确定sialin作为胞膜硝酸盐通道的候选蛋白。sialin基因沉默和sialin自然突变基因细胞转染及小型猪腮腺转导证实，sialin为哺乳动物硝酸盐转运蛋白[15]。sialin在腮腺、大脑、肝、胰腺、肾及心血管中均为高表达，sialin在唾液腺主要表达于浆液性腺胞[15]。硝酸盐经sialin转运进入细胞是硝酸盐—亚硝酸盐—一氧化氮通路发挥作用及维持机体一氧化氮稳态的关键性第一步，对全身系统功能及疾病防治具有重要意义[16]。利用CRISPR/Cas9 系统建立Slc17a5/virma二细胞胚胎敲除sialin基因小鼠，出现机体硝酸盐转运代谢异常、胃黏膜明显萎缩及相关功能障碍[17]。健康人唾液和尿液硝酸盐平均浓度为172和160 mg/L，而舍格伦综合征患者唾液和尿液硝酸盐平均浓度为36.2和465mg/L，由此可见唾液腺疾病改变了全身硝酸盐代谢[18]。
二| 硝酸盐—亚硝酸盐—一氧化氮代谢循环途径
食物硝酸盐经肠黏膜吸收进入循环系统，约75%的血液硝酸盐通过尿液排出，其余被唾液腺重吸收[1-2]。血液硝酸盐浓度在进食后15~30min达峰值，半衰期为5~8h[5]。唾液腺通过sialin摄取血液硝酸盐并分泌入唾液，唾液硝酸盐浓度可达到血液浓度的10~20倍（图1）。高浓度唾液硝酸盐被口腔细菌部分还原为亚硝酸盐及一氧化氮，硝酸盐和亚硝酸盐经肠黏膜重新吸收入血，亚硝酸盐在外周血中很快被氧化为硝酸盐，或通过脱氧血红蛋白、脱氧肌红蛋白、黄嘌呤氧化酶、细胞色素P-450、醛氧化酶和维生素C等途径还原为一氧化氮[1-2]（图2）。亚硝酸盐半衰期只有110s，但在血浆和组织中其半衰期长达数十分钟，人体正常血液亚硝酸盐浓度为50~100 nmol/L，给予富硝酸盐饮食后可提升4~5倍[5]。
注：NOS为一氧化氮合成酶
图1 硝酸盐—亚硝酸盐—一氧化氮（NO）代谢循环途径示意图
图2 经典的一氧化氮合成酶（NOS）—一氧化氮（NO）途径和硝酸盐—亚硝酸盐—NO途径示意图
三| 硝酸盐、亚硝酸盐与癌症的相关性
2010年国际癌症研究署报告称目前尚无任何实质证据证实硝酸盐在动物体内是致癌物[5]。以往流行病学使用加工或熏制肉类开展硝酸盐、亚硝酸盐与肿瘤发生的相关性研究，但这些研究忽略了此类食品在加工过程中还可形成亚硝胺等其他有害物质，导致这些研究缺乏科学性和准确性[5]。对硝酸盐和亚硝酸盐的误解多是将其与亚硝胺的有害作用混淆。流行病学调查显示，硝酸盐与胃癌、食管癌等癌症的发生无相关性[19]。Song和Guan[20]研究显示富含硝酸盐的蔬菜饮食可能具有降低胃癌发生率的作用。胃部pH异常、炎症、幽门螺杆菌催化等均可促使胃内亚硝酸盐形成亚硝胺等亚硝基化合物，故胃酸缺乏症和幽门螺杆菌感染患者胃内亚硝胺合成增多，胃癌发病率增高[21]。而植物中富含的多酚和抗氧化剂（如维生素C等）可有效降低胃内亚硝胺的合成[22]。此外，个体接触外源性亚硝胺的总量与其生活环境及习惯有关，存在较大差异。除饮食中的亚硝胺外，吸烟等不良习惯同样可导致机体摄取并积累大量亚硝胺，烟草中亚硝胺的含量为食品和饮料的100~1000倍[23]。由于日常情况下不可能接触到极高量的亚硝酸盐，亚硝酸盐引起高铁血红蛋白症的实际发生率极低。
四| 硝酸盐的生理功能及疾病防治
酶源性一氧化氮途径是经典的一氧化氮合成途径。硝酸盐—亚硝酸盐—一氧化氮途径是经典一氧化氮途径的平行途径和有力补充，发挥重要的生理功能（图3）。当氧气利用率降低、NOS活性降低时，亚硝酸盐还原为一氧化氮更加明显。因此，在以区域性和全身性缺血为主的病理条件下，从药理上或通过饮食干预硝酸盐和亚硝酸盐的储存是有益的，食物中的硝酸盐和亚硝酸盐可作为一氧化氮的有效储备来源[24]。除了非经典一氧化氮途径外，硝酸盐对机体的作用还可能存在其他机制，如硝酸盐可通过线粒体亚硝基化调节线粒体功能[1]。
图3硝酸盐的生理功能示意图
（一）硝酸盐与胃肠保护及炎症性疾病
胃肠保护是硝酸盐对人体有益的最早证据。Jin等[25]研究发现，人体在应激状态下唾液腺主动分泌硝酸盐保护胃肠道。志愿者从68m高蹦极台上跳下后，唾液硝酸盐、亚硝酸盐可上升10~20倍，并持续数小时。通过大鼠浸水应激实验发现，双腮腺导管结扎的大鼠胃黏膜溃疡、糜烂、出血和穿孔明显增加，饮水中预防性添加硝酸盐可显著减轻上述胃黏膜损害，机制上添加硝酸盐的大鼠胃中亚硝酸盐和一氧化氮水平明显升高，胃局部血流增加，血运明显改善保护胃肠道。在葡聚糖硫酸钠（dextran sodium sulfate，DSS）诱导肠炎小鼠模型中，饮水中添加硝酸盐能维持结肠的一致性，改善结肠长度，维持体重，减少结肠上皮细胞凋亡，减轻结肠和外周血中炎性细胞浸润。此外硝酸盐还可减少p53信号通路和结直肠癌通路代谢途径的富集。硝酸盐可降低肠道上皮炎症，调节肠道菌群，缓解DSS诱导的小鼠肠炎[26]。对志愿者不同种类音乐刺激下唾液及唾液中成分的研究发现，唾液亚硝酸盐浓度及静态唾液流率均有改变，古典音乐环境中非刺激性唾液流率及亚硝酸盐浓度明显升高，说明外界环境对唾液分泌及亚硝酸盐浓度具有调节作用[27]。
炎症和免疫功能障碍是导致疾病的重要原因，饮食中的硝酸盐具有抑制炎症和调节免疫的功能。体外实验发现，在非炎症条件下补充硝酸盐不会启动硝酸盐—亚硝酸盐—一氧化氮途径，而在炎症条件下硝酸盐可通过硝酸盐—亚硝酸盐—一氧化氮途径抑制核因子-κB信号通路，减少小鼠巨噬细胞白细胞介素（interleukin，IL）-6 和肿瘤坏死因子α等炎症因子的表达[28]。动物实验表明，硝酸盐饮食可降低体内炎症因子水平，如IL-1β、IL-6 和 IL-12 p70等，并减少巨噬细胞浸润[29]。健康人（n=10）连续2周每天服用250g甜菜根汁后，其血液中炎症和免疫标志物，如IL-6、干扰素-α、细胞间黏附分子以及血管细胞黏附分子等均显著降低[30]。硝酸盐主要通过抑制巨噬细胞激活和浸润抑制炎症反应，对其他白细胞如中性粒细胞也有一定作用[28-30]。饮食硝酸盐免疫调节功能在治疗和预防年龄相关疾病和其他慢性炎症相关疾病方面具有潜在应用前景。
（二）硝酸盐与心血管疾病
饮食硝酸盐通过硝酸盐—亚硝酸盐—一氧化氮途径预防和治疗心血管疾病。连续8周给予老年小鼠补充硝酸盐，小鼠左心室舒张功能、动脉顺应性和冠脉血流储备均得到改善[31]。14名健康受试者单次服用含23 mmol硝酸盐的甜菜根汁后，其收缩压可降低10 mmHg（1mmHg=0.133 kPa），舒张压降低8 mmHg[32]。硝酸盐还可有效改善缺血再灌注损伤时的血管内皮功能，并促进血流恢复。17例心力衰竭患者单次服用含12.9 mmol硝酸盐的甜菜根汁后，其心肺运动测试成绩可提高14%[33]。在肺动脉高压动物模型上，饮食添加硝酸盐可以扩张小鼠肺动脉，减轻肺动脉高压导致的右心室肥厚[33]。高血压、肥胖、肺动脉高压和脑血管疾病的发病机制与一氧化氮信号缺陷有关，小鼠长期膳食中缺乏硝酸盐可导致代谢性疾病、内皮功能障碍和心血管疾病等[2]。硝酸盐或富含硝酸盐的食物在血管内皮功能障碍、缺血再灌注损伤和肺动脉高压的临床前模型中表现出有益的生理效应。在缺氧和应激条件下硝酸盐可表现出明显的血管信号增强活性，具有一氧化氮样功能。
（三）硝酸盐与代谢性疾病
高龄、不良生活方式和不健康的饮食习惯是肥胖和2型糖尿病发病率升高的重要原因。2型糖尿病发病过程中常伴随氧化应激、一氧化氮信号受损和心血管疾病等。在链脲佐菌素诱导的2型糖尿病大鼠模型中，连续2个月在饮水中添加100 mg/L硝酸钠，大鼠葡萄糖耐量和过氧化氢酶活性均显著改善，糖异生减少，空腹血糖和血液IL-1β水平降低[2]。增加一氧化氮生物利用度的策略可能对代谢综合征和2型糖尿病具有治疗潜力。硝酸盐—亚硝酸盐—一氧化氮信号通路靶点包括氧化应激和脂肪褐变，同时激活典型的代谢调节通路，包括5′-一磷酸腺苷激活的蛋白激酶（5′-AMP activated protein kinase，AMPK）和葡萄糖转运蛋白4，这与当前使用的几种降糖药包括双胍类药物影响的通路相似[2]。对小鼠给予高脂饮食同时加载硝酸盐饮水，7周后实验动物出现肥胖等代谢性疾病，而硝酸盐通过降低烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶诱导的氧化应激、AMPK及下游信号通路调控脂肪生成、脂肪酸氧化和葡萄糖稳态[34]。饮食硝酸盐可作为一种预防和治疗代谢性疾病经济、高效和特异性的饮食治疗策略。
（四）硝酸盐与运动
动物实验发现，衰老可导致机体运动机能下降，连续8周在饮水中添加低浓度亚硝酸钠可显著增加衰老小鼠的握力[35]。在一项人体试验中，富含硝酸盐的饮食可降低运动休息时的初始肌肉放电率，并降低疲劳运动中的平均和最大放电率，硝酸盐通过改善肌肉神经功能和耗氧量增强运动机能[36]。给予自行车运动员连续3d富含硝酸盐的甜菜根汁饮料，运动员血浆亚硝酸盐浓度增加1倍，其运动过程中耗氧量减少约5%[37]。饮食中补充硝酸盐可降低运动耗氧，提高肌肉效率，从而改善耐力运动和短跑运动能力。一氧化氮对神经肌肉活动、肌肉兴奋收缩偶联（通过Ca2+活性）、线粒体呼吸、血流量的调节均有重要作用[1-2]。因此，保持适当的一氧化氮含量在机体运动中非常重要。在非精英运动员受试者中，当遵循适当的补充方案时，对肌肉功能的影响比较明显。饮食硝酸盐与其他特定的功能助剂相比，其对肌肉收缩性和肌肉效率的影响范围更广。
（五）硝酸盐与衰老及放射损伤
笔者课题组对衰老动物模型的研究显示，每日摄入硝酸盐（0.5 mmol/L）可恢复D-半乳糖诱导的衰老小鼠和自然衰老小鼠肝组织内硝酸盐水平，降低谷丙转氨酶和天门冬氨酸氨基转移酶水平，防止肝组织细胞衰老和结构及糖脂代谢的退化。这些证据说明硝酸盐具有缓解衰老导致的肝脏退行性变及肝脏细胞凋亡的作用[38]。在去势大鼠唾液腺功能障碍模型上，在摘除卵巢的雌性大鼠饮水中加入适量硝酸盐3个月，大鼠唾液分泌增加，唾液腺纤维化面积减少，细胞凋亡减少。硝酸盐通过降低下颌下腺细胞凋亡比率恢复唾液分泌功能[39]。在小鼠放射治疗前一周在饮水中加入硝酸盐预处理，小鼠放疗后体重下降趋势明显缓解，肺部及下颌下腺组织中氧自由基水平和细胞凋亡数量显著低于对照组[40]。进一步观察表明，外源性补充硝酸盐可激活体内硝酸盐—亚硝酸盐—NO通路，从而发挥一氧化氮的诸多生理作用，包括舒张血管、清除活性氧自由基及改善缺血再灌注损伤[40]。
五| 结语
近年来，越来越多的研究认为食物硝酸盐在机体中发挥着一氧化氮样重要的生理功能。硝酸盐具有广泛的生理作用，包括调节血管张力、抗氧化、提高肌肉运功能力、抑制炎性因子释放、调节糖代谢、调节肠道菌群等。同时，硝酸盐对卒中、心肌梗死、肺动脉高压、放射损伤、糖尿病、炎症、应激性胃溃疡及衰老相关疾病等具有治疗和预防潜能。饮食硝酸盐对机体无危害，硝酸盐与肿瘤的发生并无相关性。人们对于硝酸盐危害的认知被证明并无依据，且忽略了硝酸盐的重要生理功能。未来硝酸盐有望广泛应用于保健领域，随着研究的深入硝酸盐可能以缓释剂型和复合制剂等药用方式应用于临床疾病的防治，包括胃肠保护，心血管、代谢性疾病及放射损伤防护等。相信随着对硝酸盐研究的不断深入及对其有益作用的不断挖掘，硝酸盐可以更好地造福人类。
利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突
志谢 首都医科大学口腔医学院唾液腺疾病中心及牙再生与口腔功能重建北京市重点实验室胡亮博士对文章的修订
作者贡献声明 秦力铮：论文撰写及修订；靳路远、曲兴民：论文修订；王松灵：全文指导、论文撰写及修订 返回搜狐，查看更多
