氨基酸分析方法的研究进展
第33卷2005年3月
分析化学(FENXIHUAXUE) 评述与进展
ChineseJournalofAnalyticalChemistry
第3期398~404
评述与进展
氨基酸分析方法的研究进展
于 泓
1
1,2
牟世芬
2
*1
(中国科学院生态环境研究中心,北京100085) (哈尔滨师范大学化学系,哈尔滨150080)
摘 要 对目前应用于氨基酸分析的主要方法作了较详细评述。这些方法包括柱后衍生高效阳离子交换色谱法、柱前衍生反相高效液相色谱法、高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法等。引用文献73篇。关键词 氨基酸,色谱法,评述
1 引 言
迄今为止,自然界中已发现180多种氨基酸,其中参与蛋白质合成的氨基酸只有20多种,称为基本氨基酸。氨基酸主要有两种存在形式,一种是以游离态存在于生理体液(血浆、尿)、食品(酒、饮料)中,另一种是以结合态存在于肽和蛋白质中。由于氨基酸分析在蛋白质化学、生物化学、食品科学、临床医学等领域的研究中起着重要的作用,因此,对氨基酸分析方法的研究与改进得到人们高度重视。1958
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年,Spackman等首先提出了用阳离子交换色谱与柱后茚三酮衍生结合的方法分析蛋白质中的氨基酸,实现了氨基酸分析的自动化。其后,人们不断地发展新的氨基酸分析方法,柱前衍生反相高效液相色谱法、高效阴离子交换色谱-积分脉冲安培检测法等相继应用于氨基酸分析。现已是多种氨基酸分析方法并存、互补。本文就目前应用于氨基酸分析的主要方法作一综述。
2 柱后衍生高效阳离子交换色谱法
高效阳离子交换色谱(HPCEC)-柱后茚三酮衍生光度检测分离测定氨基酸是一种经典的氨基酸分析方法。此方法是利用氨基酸在酸性条件下形成阳离子而在阳离子交换柱中分离,分离后的氨基酸用茚三酮衍生、紫外可见光度检测器检测。采用阳离子交换色谱分离、柱后茚三酮衍生光度检测技术的商品化的自动氨基酸分析仪在20世纪60年代初问世。现在的自动氨基酸分析仪已实现了程控自动化和数据处理电脑化,分析时间已缩短至1h以内。
目前,专用氨基酸分析仪的色谱柱主要是以磺酸型强酸性阳离子交换树脂为柱填料。该树脂是由苯乙烯和二乙烯基本聚合后磺化而成,球状树脂的粒度一般在5~10Lm之间,交联度多为8%~12%。流动相一般采用3~5种不同pH值的缓冲液(柠檬酸钠或柠檬酸锂等)。氨基酸的分离不仅受离子交换树脂的型号、交联度和粒度的影响,还受柱温、洗脱缓冲液的阳离子类型、pH、离子强度、淋洗梯度、流速以及其中有机溶剂含量的影响。
由于大多数氨基酸在紫外可见光区无吸收,因此必须将其衍生、转化为具有紫外可见吸收或能产生荧光的物质才能检测。茚三酮是最常用的柱后衍生化试剂。采用茚三酮作柱后衍生试剂的方法被认为是这一技术的标准方法(AOAC采用的氨基酸分析标准方法)。这种方法的优点是准确、可靠、重现性好,能测定大量氨基酸及其同系物。方法的不足是灵敏度不高,只可对100pmol以上的氨基酸进行准
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确分析,而且需要双波长检测,在440nm处检测脯氨酸,在570nm处检测其它氨基酸。
为了提高分析灵敏度,用荧光胺代替茚三酮作柱后衍生试剂,采用荧光检测,可检测几个pmol的氨基酸
[3]
。荧光胺与氨反应的灵敏度比茚三酮与氨反应的灵敏度大约提高了3个数量级。这样,测定中
2003-07-16收稿;2003-11-17接受
本文系国家重点基础研究计划(973)项目(No.2003CB415001)和国家自然科学基金(No.20475060)资助课题
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网址: 氨基酸分析方法的研究进展 https://m.trfsz.com/newsview1605076.html
