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甲壳素类物质在制备调节人体酸碱平衡的制品中的应用的制作方法

泰然健康网
2025-08-10 21:18

专利名称：甲壳素类物质在制备调节人体酸碱平衡的制品中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种甲壳素类物质的用途。
背景技术：
生物有机体在稳定的内环境中执行各种不同的功能，细胞pH是反映内环境稳定的一项重要指标，它在调节细胞新陈代谢中起重要作用。真核细胞一个合适的胞浆pH，应该控制在7.0-7.4的范围。同时，细胞pH受到细胞质膜各种离子转运系统的严格监控，包括(1)Na+/H+交换系统；(2)Na+、Cl-/HCO3-交换系统；(3)Cl-/HCO3-交换系统，等等[Vanghan-Jones，R等人，“Journal of Physiology”，第428期，第441-446页(1990)]。在现代社会，由于高糖、高脂或大量酸性食物摄入造成的饮食不均，或不同疾病造成的局部缺氧，或劳累过度产生大量乳酸等等原因，导致人体常常处于一个偏酸性的内环境，从而造成细胞的损害或死亡，甚至影响正常的免疫调节与生理功能。基于此，研究者们着眼于调节细胞酸碱性，希望开发出能够降低细胞酸度、升高机体内环境pH值的生物制品。科研人员从大枣中分离纯化出了一种中性多糖，发现能够促使小鼠腹腔巨噬细胞内pH升高，并能进一步活化巨噬细胞，促进IL-1、TNF的表达上调，以及钙离子浓度明显升高[张庆等人，“中药药理与临床”，第18卷第1期，第8-9页(2002)]。还有人采用激光扫描共聚焦技术(LSCM)考察灵芝多糖对于小鼠T细胞的影响，发现该多糖通过引起T细胞钙离子浓度与pH值快速升高，发挥增强免疫与抗肿瘤的生物活性[李明春等人，“中国药理学通报”，第17卷第2期，第167-170页(2001)]。
同样作为天然来源的多糖物质，甲壳素又称几丁质(chitin)、甲壳质，壳聚糖(chitosan)又称几丁聚糖、壳寡糖是脱乙酰基的甲壳素(chitin)，属于甲壳素的衍生物，甲壳低聚糖是甲壳素通过几丁酶分解、翠取、高压层析、分离、提纯后的产品，属于甲壳素的衍生物，氨基葡萄糖盐类，是甲壳素的分解产品，通过离子交换、冷冻干燥制得，N-乙酰氨基葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖甲缩醛也是甲壳素得衍生物，壳聚糖(chitosan)又称几丁聚糖、壳寡糖是脱乙酰基的甲壳素(chitin)，属于甲壳素的衍生物，它们在自然界分布很广，如某些菌类的细胞壁，某些藻类以及虾、蟹、昆虫等的骨酪及外壳等。根据推测，目前地球上甲壳素的年产量约为(10～100)×109吨，是仅次于纤维素(约为100×109吨)的第二大天然资源。近年来随着科学技术的突飞猛进，人们对甲壳素和壳聚糖的认识大大深入，已经广泛运用于工业污水处理，促农业作物生长以及医药、化妆品、食品等领域，被公认为很有发展前途的天然高分子化合物[Yalpani，M等人，“Chitin，ChitosanSources，Chemistry，Biochemistry，Physical Properties and Applications”，荷兰elsevier出版公司(1992)]。由于其各方面的优异性能和多种用途，1995年美国药物食品管理局(FDA)及欧共体(EC)已批准壳聚糖生产，作为保健食品。低分子量壳聚糖的保健功能并不限于某些特定的器官，而是可作用于人体全身。甲壳素的基本单位N-乙酰葡萄糖也是构成人体的重要物质--透明质酸的组成单元，于人体有很好的亲和性，不会对人体产生排斥作用。壳聚糖对疾病的预防和保健作用包括强化免疫功能、降低胆固醇、降血压、降血糖、强化肝脏机能、对神经内分泌系统有调节作用、使血管扩张，从而改善腰酸背痛症状；治疗烧伤、烫伤、加速外伤愈合；增殖肠道有益菌；调节免疫功能；防治痛风及尿酸过多症；防治胃溃疡；吸附体内有害物质并排出体外等。同时，毒理学研究证明壳聚糖具有无毒性、无刺激性、无免疫原性、无热原反应、不溶血和无致突变反应等特点，具有极好的生物相容性[吕明等人，“中国海洋药物”，第83期，第30-34页(2001)]。

发明内容
本发明的目的在于提供一种甲壳素类物质的用途，是甲壳素类物质在制备调节人体酸碱平衡的制品中的应用。
本发明的技术解决方案是一种甲壳素类物质在制备调节人体酸碱平衡的制品中的应用。
甲壳素类物质是甲壳素、壳聚糖、甲壳低聚糖、氨基葡萄糖盐类、N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖甲缩醛等甲壳素得衍生物。
本发明提供了甲壳素类物质的新用途，它具有升高细胞生存环境的pH值，减少酸性环境对细胞体的损害，从而调节机体内环境的酸碱性，维持生物有机体进行正常的新陈代谢的功效。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1为甲壳素与壳聚糖的分子结构示意图，图中chitin为甲壳素，chitosan为壳聚糖。
图2为壳聚糖在酸性溶液中调节pH值示意图。
图3(a)为正常培养液中的L929细胞形态图。
图3(b)为在酸性细胞培养液中培养2.5小时后的L929细胞形态图。
图3(c)为在酸性细胞培养液中培养12.5小时后的L929细胞形态图。
图3(d)为在酸性细胞培养液中培养2.5小时后，加入壳聚糖培养10小时后的L929细胞形态图。
图4(a)为正常培养液中的Raw264.7细胞形态图。
图4(b)为在酸性细胞培养液中培养0.5小时后的Raw264.7细胞形态图。
图4(c)为在酸性细胞培养液中培养10.5小时后的Raw264.7细胞形态图。
图4(d)为在酸性细胞培养液中培养0.5小时后，加入壳聚糖培养10小时后的Raw264.7细胞形态图。
图5(a)为正常培养液中的HUVEC细胞形态图。
图5(b)为在酸性细胞培养液中培养3小时后的HUVEC细胞形态图。
图5(c)为在酸性细胞培养液中培养14小时后的HUVEC细胞形态图。
图5(d)为在酸性细胞培养液中培养3小时后，加入壳聚糖培养11小时后的HUVEC细胞形态图。
具体实施例方式实施例1将壳聚糖用于制备调节人体酸碱平衡的制品，例单独的壳聚糖。
实验(1)壳聚糖在酸性溶液中调节pH值实验在数显pH计(意大利Hanna公司产品)的即时监控下，滴加冰醋酸至双蒸水中，配制40毫升醋酸溶液，测得pH值为3.11±0.01。向其中加入50毫克壳聚糖粉末，充分搅拌使其溶解，待溶液稳定，测量pH值；重复此过程三次，每次均加入50毫克壳聚糖，同法处理并测量溶液的pH值。绘制“溶液pH值——壳聚糖浓度”曲线，见图2。
实验结果证明，在酸性溶液中加入壳聚糖粉末，可明显升高溶液pH值。
(2)酸性细胞培养液的配制称取RPMI-1640干粉培养基(Gibco产品)，溶解于溶剂PBS中，浓度为10克/1升，充分搅拌后静置。称取MES(2-(N-吗啉代)乙烷磺酸)，浓度为26毫摩尔/升，此时培液pH为5.01±0.01。
(3)壳聚糖在酸性培液中调节细胞pH值实验(一)鼠肺成纤维L929细胞购自中国科学院细胞库，常规保存于含10％胎牛血清，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的RPMI-1640(Gibco产品)培液中，细胞培养箱温度37℃，含5％二氧化碳。取生长良好的细胞，用胰蛋白酶和EDTA消化，按照密度为4×104个/毫升，0.5毫升每孔接种于24孔培养板(Costar产品)。待其完全贴壁生长后，吸去各孔上清培液，设置“空白对照组”与“实验组”，在空白对照组中加入0.5毫升无血清RPMI-1640培液，在“实验组”中加入0.5毫升酸性细胞培养液。2.5小时用光学显微镜观察细胞生长状态，将“实验组”分为“阴性对照组”与“样品组”，在样品组中加入壳聚糖，保证壳聚糖浓度为450微克/毫升。10小时后，用光学显微镜观察“阴性对照组”与“样品组”的细胞生长状态。
细胞状态观察表明，在“实验组”中加入酸性细胞培养液2.5小时后，细胞生长状况明显不如空白对照组，部分细胞开始出现死亡的迹象，见图3(a)，图3(b)。10小时后，“阴性对照组”细胞生长状况很差，大部分细胞死亡，见图3(c)；而“样品组”细胞生长状况得到明显好转，接近“空白对照组”，图3(d)。
(4)壳聚糖在酸性培液中调节细胞pH值实验(二)鼠单核巨噬细胞Raw264.7购自美国模式菌种收藏中心(ATCC)，常规保存于含10％胎牛血清，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的DMEM(Gibco产品)培液中，细胞培养箱温度37℃，含5％二氧化碳。取生长良好的细胞，用胰蛋白酶和EDTA消化，按照密度为4×104个/毫升，0.5毫升每孔接种于24孔培养板(Costar产品)。待其完全贴壁生长后，吸去各孔上清培液，设置“空白对照组”与“实验组”，在空白对照组中加入0.5毫升无血清RPMI-1640培液，在“实验组”中加入0.5毫升酸性细胞培养液。0.5小时用光学显微镜观察细胞生长状态，将“实验组”分为“阴性对照组”与“样品组”，在样品组中加入壳聚糖，保证壳聚糖浓度为150微克/毫升。10小时后，用光学显微镜观察“阴性对照组”与“样品组”的细胞生长状态。
细胞状态观察表明，在“实验组”中加入酸性细胞培养液0.5小时后，细胞生长状况明显不如空白对照组，部分细胞开始出现死亡的迹象，见图4(a)，图4(b)。10小时后，“阴性对照组”细胞生长状况很差，大部分细胞死亡，见图4(c)；而“样品组”细胞生长状况得到明显好转，接近“空白对照组”，图4(d)。
(5)壳聚糖在酸性培液中调节细胞pH值实验(三)人脐静脉血管内皮细胞HUVEC从脐带中分离，具体方法为取新鲜健康的胎儿脐带，灌入5％胶原酶，37℃水浴15-20分钟，用PBS冲洗脐静脉，离心，弃上清，用培养液悬浮细胞，置含10％胎牛血清，10纳克/毫升血管内皮生长因子(VEGF，R&D产品)，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的DMEM培液中，细胞培养箱温度37℃，含5％二氧化碳，用兔抗人第八因子抗体进行免疫组化鉴定。
用胰蛋白酶和EDTA消化，取第4-7代生长良好的细胞，按照密度为6×104个/毫升，去各孔上清培液，设置“空白对照组”与“实验组”，在空白对照组中加入0.5毫升无血清RPMI-1640培液，在“实验组”中加入0.5毫升酸性细胞培养液。0.5小时用光学显微镜观察细胞生长状态，将“实验组”分为“阴性对照组”与“样品组”，在样品组中加入壳聚糖，保证壳聚糖浓度为350微克/毫升。11小时后，用光学显微镜观察“阴性对照组”与“样品组”的细胞生长状态。
细胞状态观察表明，在“实验组”中加入酸性细胞培养液3小时后，细胞生长状况明显不如空白对照组，部分细胞开始出现死亡的迹象，见图5(a)，图5(b)。11小时后，“阴性对照组”细胞生长状况很差，大部分细胞死亡，，见图5(c)；而“样品组”细胞生长状况得到明显好转，接近“空白对照组”，图5(d)。
实施例2将脱乙酰基甲壳素用于制备调节人体酸碱平衡的制品，例单独的脱乙酰基甲壳素。
实验(1)脱乙酰基甲壳素(即甲壳素)在酸性溶液中调节pH值实验在数显pH计(意大利Hanna公司产品)的即时监控下，滴加冰醋酸至双蒸水中，配制40毫升醋酸溶液，测得pH值为3.11±0.01。向其中加入50毫克脱乙酰基甲壳素粉末，充分搅拌使其溶解，待溶液稳定，测量pH值；重复此过程三次，每次均加入50毫克脱乙酰基甲壳素，同法处理并测量溶液的pH值。
实验结果证明，在酸性溶液中加入脱乙酰基甲壳素粉末，可明显升高溶液pH值。
(2)酸性细胞培养液的配制称取RPMI-1640干粉培养基(Gibco产品)，溶解于溶剂PBS中，浓度为10克/1升，充分搅拌后静置。称取MES(2-(N-吗啉代)乙烷磺酸)，浓度为26毫摩尔/升，此时培液pH为5.01±0.01。
(3)脱乙酰基甲壳素在酸性培液中调节细胞pH值实验(一)鼠肺成纤维L929细胞购自中国科学院细胞库，常规保存于含10％胎牛血清，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的RPMI-1640(Gibco产品)培液中，细胞培养箱温度37℃，含5％二氧化碳。取生长良好的细胞，用胰蛋白酶和EDTA消化，按照密度为4×104个/毫升，0.5毫升每孔接种于24孔培养板(Costar产品)。待其完全贴壁生长后，吸去各孔上清培液，设置“空白对照组”与“实验组”，在空白对照组中加入0.5毫升无血清RPMI-1640培液，在“实验组”中加入0.5毫升酸性细胞培养液。2.5小时用光学显微镜观察细胞生长状态，将“实验组”分为“阴性对照组”与“样品组”，在样品组中加入脱乙酰基甲壳素，保证脱乙酰基甲壳素浓度为450微克/毫升。10小时后，用光学显微镜观察“阴性对照组”与“样品组”的细胞生长状态。
细胞状态观察表明，在“实验组”中加入酸性细胞培养液2.5小时后，细胞生长状况明显不如空白对照组，部分细胞开始出现死亡的迹象。10小时后，“阴性对照组”细胞生长状况很差，大部分细胞死亡；而“样品组”细胞生长状况得到明显好转，接近“空白对照组”。
(4)脱乙酰基甲壳素在酸性培液中调节细胞pH值实验(二)鼠单核巨噬细胞Raw264.7购自美国模式菌种收藏中心(ATCC)，常规保存于含10％胎牛血清，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的DMEM(Gibco产品)培液中，细胞培养箱温度37℃，含5％二氧化碳。取生长良好的细胞，用胰蛋白酶和EDTA消化，按照密度为4×104个/毫升，0.5毫升每孔接种于24孔培养板(Costar产品)。待其完全贴壁生长后，吸去各孔上清培液，设置“空白对照组”与“实验组”，在空白对照组中加入0.5毫升无血清RPMI-1640培液，在“实验组”中加入0.5毫升酸性细胞培养液。0.5小时用光学显微镜观察细胞生长状态，将“实验组”分为“阴性对照组”与“样品组”，在样品组中加入脱乙酰基甲壳素，保证脱乙酰基甲壳素浓度为150微克/毫升。10小时后，用光学显微镜观察“阴性对照组”与“样品组”的细胞生长状态。
细胞状态观察表明，在“实验组”中加入酸性细胞培养液0.5小时后，细胞生长状况明显不如空白对照组，部分细胞开始出现死亡的迹象。10小时后，“阴性对照组”细胞生长状况很差，大部分细胞死亡；而“样品组”细胞生长状况得到明显好转，接近“空白对照组”。
(5)脱乙酰基甲壳素在酸性培液中调节细胞pH值实验(三)人脐静脉血管内皮细胞HUVEC从脐带中分离，具体方法为取新鲜健康的胎儿脐带，灌入5％胶原酶，37℃水浴15-20分钟，用PBS冲洗脐静脉，离心，弃上清，用培养液悬浮细胞，置含10％胎牛血清，10纳克/毫升血管内皮生长因子(VEGF，R&D产品)，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的DMEM培液中，细胞培养箱温度37℃，含5％二氧化碳，用兔抗人第八因子抗体进行免疫组化鉴定。
用胰蛋白酶和EDTA消化，取第4-7代生长良好的细胞，按照密度为6×104个/毫升，去各孔上清培液，设置“空白对照组”与“实验组”，在空白对照组中加入0.5毫升无血清RPMI-1640培液，在“实验组”中加入0.5毫升酸性细胞培养液。0.5小时用光学显微镜观察细胞生长状态，将“实验组”分为“阴性对照组”与“样品组”，在样品组中加入脱乙酰基甲壳素，保证脱乙酰基甲壳素浓度为350微克/毫升。11小时后，用光学显微镜观察“阴性对照组”与“样品组”的细胞生长状态。
细胞状态观察表明，在“实验组”中加入酸性细胞培养液3小时后，细胞生长状况明显不如空白对照组，部分细胞开始出现死亡的迹象。11小时后，“阴性对照组”细胞生长状况很差，大部分细胞死亡；而“样品组”细胞生长状况得到明显好转，接近“空白对照组”。
将脱乙酰基甲壳素用于制备调节人体酸碱平衡的制品，例单独的脱乙酰基甲壳素。
实施例3将低聚糖用于制备调节人体酸碱平衡的制品，例单独的低聚糖。
实验(1)甲壳低聚糖在酸性溶液中调节pH值实验在数显pH计(意大利Hanna公司产品)的即时监控下，滴加冰醋酸至双蒸水中，配制40毫升醋酸溶液，测得pH值为3.11±0.01。向其中加入50毫克甲壳低聚糖粉末，充分搅拌使其溶解，待溶液稳定，测量pH值；重复此过程三次，每次均加入50毫克甲壳低聚糖，同法处理并测量溶液的pH值。
实验结果证明，在酸性溶液中加入甲壳低聚糖粉末，可明显升高溶液pH值。
(2)酸性细胞培养液的配制称取RPMI-1640干粉培养基(Gibco产品)，溶解于溶剂PBS中，浓度为10克/1升，充分搅拌后静置。称取MES(2-(N-吗啉代)乙烷磺酸)，浓度为26毫摩尔/升，此时培液pH为5.01±0.01。
(3)甲壳低聚糖在酸性培液中调节细胞pH值实验(一)鼠肺成纤维L929细胞购自中国科学院细胞库，常规保存于含10％胎牛血清，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的RPMI-1640(Gibco产品)培液中，细胞培养箱温度37℃，含5％二氧化碳。取生长良好的细胞，用胰蛋白酶和EDTA消化，按照密度为4×104个/毫升，0.5毫升每孔接种于24孔培养板(Costar产品)。待其完全贴壁生长后，吸去各孔上清培液，设置“空白对照组”与“实验组”，在空白对照组中加入0.5毫升无血清RPMI-1640培液，在“实验组”中加入0.5毫升酸性细胞培养液。2.5小时用光学显微镜观察细胞生长状态，将“实验组”分为“阴性对照组”与“样品组”，在样品组中加入甲壳低聚糖，保证甲壳低聚糖浓度为450微克/毫升。10小时后，用光学显微镜观察“阴性对照组”与“样品组”的细胞生长状态。
细胞状态观察表明，在“实验组”中加入酸性细胞培养液2.5小时后，细胞生长状况明显不如空白对照组，部分细胞开始出现死亡的迹象。10小时后，“阴性对照组”细胞生长状况很差，大部分细胞死亡；而“样品组”细胞生长状况得到明显好转，接近“空白对照组”。
(4)甲壳低聚糖在酸性培液中调节细胞pH值实验(二)鼠单核巨噬细胞Raw264.7购自美国模式菌种收藏中心(ATCC)，常规保存于含10％胎牛血清，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的DMEM(Gibco产品)培液中，细胞培养箱温度37℃，含5％二氧化碳。取生长良好的细胞，用胰蛋白酶和EDTA消化，按照密度为4×104个/毫升，0.5毫升每孔接种于24孔培养板(Costar产品)。待其完全贴壁生长后，吸去各孔上清培液，设置“空白对照组”与“实验组”，在空白对照组中加入0.5毫升无血清RPMI-1640培液，在“实验组”中加入0.5毫升酸性细胞培养液。0.5小时用光学显微镜观察细胞生长状态，将“实验组”分为“阴性对照组”与“样品组”，在样品组中加入甲壳低聚糖，保证甲壳低聚糖浓度为150微克/毫升。10小时后，用光学显微镜观察“阴性对照组”与“样品组”的细胞生长状态。
细胞状态观察表明，在“实验组”中加入酸性细胞培养液0.5小时后，细胞生长状况明显不如空白对照组，部分细胞开始出现死亡的迹象。10小时后，“阴性对照组”细胞生长状况很差，大部分细胞死亡；而“样品组”细胞生长状况得到明显好转，接近“空白对照组”。
(5)甲壳低聚糖在酸性培液中调节细胞pH值实验(三)按照实施例1所述方法制备甲壳低聚糖，按实施例3配制酸性细胞培养液。
人脐静脉血管内皮细胞HUVEC从脐带中分离，具体方法为取新鲜健康的胎儿脐带，灌入5％胶原酶，37℃水浴15-20分钟，用PBS冲洗脐静脉，离心，弃上清，用培养液悬浮细胞，置含10％胎牛血清，10纳克/毫升血管内皮生长因子(VEGF，R&D产品)，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的DMEM培液中，细胞培养箱温度37℃，含5％二氧化碳，用兔抗人第八因子抗体进行免疫组化鉴定。
用胰蛋白酶和EDTA消化，取第4-7代生长良好的细胞，按照密度为6×104个/毫升，去各孔上清培液，设置“空白对照组”与“实验组”，在空白对照组中加入0.5毫升无血清RPMI-1640培液，在“实验组”中加入0.5毫升酸性细胞培养液。0.5小时用光学显微镜观察细胞生长状态，将“实验组”分为“阴性对照组”与“样品组”，在样品组中加入甲壳低聚糖，保证甲壳低聚糖浓度为350微克/毫升。11小时后，用光学显微镜观察“阴性对照组”与“样品组”的细胞生长状态。
细胞状态观察表明，在“实验组”中加入酸性细胞培养液3小时后，细胞生长状况明显不如空白对照组，部分细胞开始出现死亡的迹象。11小时后，“阴性对照组”细胞生长状况很差，大部分细胞死亡；而“样品组”细胞生长状况得到明显好转，接近“空白对照组”。
实施例4将氨基葡萄糖硫酸盐(或氨基葡萄糖盐酸盐)用于制备调节人体酸碱平衡的制品，例单独的氨基葡萄糖硫酸盐(或氨基葡萄糖盐酸盐)。
(1)氨基葡萄糖盐在酸性溶液中调节pH值实验在数显pH计(意大利Hanna公司产品)的即时监控下，滴加冰醋酸至双蒸水中，配制40毫升醋酸溶液，测得pH值为3.11±0.01。向其中加入50毫克氨基葡萄糖硫酸盐(或氨基葡萄糖盐酸盐)粉末，充分搅拌使其溶解，待溶液稳定，测量pH值；重复此过程三次，每次均加入50毫克氨基葡萄糖硫酸盐(或氨基葡萄糖盐酸盐)，同法处理并测量溶液的pH值。
实验结果证明，在酸性溶液中加入氨基葡萄糖硫酸盐(或氨基葡萄糖盐酸盐)粉末，可明显升高溶液pH值。
(2)酸性细胞培养液的配制称取RPMI-1640干粉培养基(Gibco产品)，溶解于溶剂PBS中，浓度为10克/1升，充分搅拌后静置。称取MES(2-(N-吗啉代)乙烷磺酸)，浓度为26毫摩尔/升，此时培液pH为5.01±0.01。
(3)氨基葡萄糖盐在酸性培液中调节细胞pH值实验(一)鼠肺成纤维L929细胞购自中国科学院细胞库，常规保存于含10％胎牛血清，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的RPMI-1640(Gibco产品)培液中，细胞培养箱温度37℃，含5％二氧化碳。取生长良好的细胞，用胰蛋白酶和EDTA消化，按照密度为4×104个/毫升，0.5毫升每孔接种于24孔培养板(Costar产品)。待其完全贴壁生长后，吸去各孔上清培液，设置“空白对照组”与“实验组”，在空白对照组中加入0.5毫升无血清RPMI-1640培液，在“实验组”中加入0.5毫升酸性细胞培养液。2.5小时用光学显微镜观察细胞生长状态，将“实验组”分为“阴性对照组”与“样品组”，在样品组中加入氨基葡萄糖硫酸盐(或氨基葡萄糖盐酸盐)，保证氨基葡萄糖硫酸盐(或氨基葡萄糖盐酸盐)浓度为450微克/毫升。10小时后，用光学显微镜观察“阴性对照组”与“样品组”的细胞生长状态。
细胞状态观察表明，在“实验组”中加入酸性细胞培养液2.5小时后，细胞生长状况明显不如空白对照组，部分细胞开始出现死亡的迹象。10小时后，“阴性对照组”细胞生长状况很差，大部分细胞死亡；而“样品组”细胞生长状况得到明显好转，接近“空白对照组”。
(4)氨基葡萄糖盐在酸性培液中调节细胞pH值实验(二)鼠单核巨噬细胞Raw264.7购自美国模式菌种收藏中心(ATCC)，常规保存于含10％胎牛血清，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的DMEM(Gibco产品)培液中，细胞培养箱温度37℃，含5％二氧化碳。取生长良好的细胞，用胰蛋白酶和EDTA消化，按照密度为4×104个/毫升，0.5毫升每孔接种于24孔培养板(Costar产品)。待其完全贴壁生长后，吸去各孔上清培液，设置“空白对照组”与“实验组”，在空白对照组中加入0.5毫升无血清RPMI-1640培液，在“实验组”中加入0.5毫升酸性细胞培养液。0.5小时用光学显微镜观察细胞生长状态，将“实验组”分为“阴性对照组”与“样品组”，在样品组中加入氨基葡萄糖硫酸盐(或氨基葡萄糖盐酸盐)，保证氨基葡萄糖硫酸盐(或氨基葡萄糖盐酸盐)浓度为150微克/毫升。10小时后，用光学显微镜观察“阴性对照组”与“样品组”的细胞生长状态。
细胞状态观察表明，在“实验组”中加入酸性细胞培养液0.5小时后，细胞生长状况明显不如空白对照组，部分细胞开始出现死亡的迹象。10小时后，“阴性对照组”细胞生长状况很差，大部分细胞死亡；而“样品组”细胞生长状况得到明显好转，接近“空白对照组”。
(5)氨基葡萄糖盐在酸性培液中调节细胞pH值实验(三)人脐静脉血管内皮细胞HUVEC从脐带中分离，具体方法为取新鲜健康的胎儿脐带，灌入5％胶原酶，37℃水浴15-20分钟，用PBS冲洗脐静脉，离心，弃上清，用培养液悬浮细胞，置含10％胎牛血清，10纳克/毫升血管内皮生长因子(VEGF，R&D产品)，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的DMEM培液中，细胞培养箱温度37℃，含5％二氧化碳，用兔抗人第八因子抗体进行免疫组化鉴定。
用胰蛋白酶和EDTA消化，取第4-7代生长良好的细胞，按照密度为6×104个/毫升，去各孔上清培液，设置“空白对照组”与“实验组”，在空白对照组中加入0.5毫升无血清RPMI-1640培液，在“实验组”中加入0.5毫升酸性细胞培养液。0.5小时用光学显微镜观察细胞生长状态，将“实验组”分为“阴性对照组”与“样品组”，在样品组中加入氨基葡萄糖硫酸盐(或氨基葡萄糖盐酸盐)，保证氨基葡萄糖硫酸盐(或氨基葡萄糖盐酸盐)浓度为350微克/毫升。11小时后，用光学显微镜观察“阴性对照组”与“样品组”的细胞生长状态。
细胞状态观察表明，在“实验组”中加入酸性细胞培养液3小时后，细胞生长状况明显不如空白对照组，部分细胞开始出现死亡的迹象。11小时后，“阴性对照组”细胞生长状况很差，大部分细胞死亡；而“样品组”细胞生长状况得到明显好转，接近“空白对照组”。
实施例5将N-乙酰氨基葡萄糖甲缩醛(或N-乙酰氨基葡萄糖)用于制备调节人体酸碱平衡的制品，例单独的N-乙酰氨基葡萄糖甲缩醛(或N-乙酰氨基葡萄糖)。
实验(1)N-乙酰氨基葡萄糖甲缩醛(或N-乙酰氨基葡萄糖)在酸性溶液中调节pH值实验在数显pH计(意大利Hanna公司产品)的即时监控下，滴加冰醋酸至双蒸水中，配制40毫升醋酸溶液，测得pH值为3.11±0.01。向其中加入50毫克N-乙酰氨基葡萄糖甲缩醛(或N-乙酰氨基葡萄糖)粉末，充分搅拌使其溶解，待溶液稳定，测量pH值；重复此过程三次，每次均加入50毫克N-乙酰氨基葡萄糖甲缩醛(或N-乙酰氨基葡萄糖)，同法处理并测量溶液的pH值。
实验结果证明，在酸性溶液中加入N-乙酰氨基葡萄糖甲缩醛(或N-乙酰氨基葡萄糖)粉末，可明显升高溶液pH值。
(2)酸性细胞培养液的配制称取RPMI-1640干粉培养基(Gibco产品)，溶解于溶剂PBS中，浓度为10克/1升，充分搅拌后静置。称取MES(2-(N-吗啉代)乙烷磺酸)，浓度为26毫摩尔/升，此时培液pH为5.01±0.01。
(3)N-乙酰氨基葡萄糖甲缩醛(或N-乙酰氨基葡萄糖)在酸性培液中调节细胞pH值实验(一)鼠肺成纤维L929细胞购自中国科学院细胞库，常规保存于含10％胎牛血清，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的RPMI-1640(Gibco产品)培液中，细胞培养箱温度37℃，含5％二氧化碳。取生长良好的细胞，用胰蛋白酶和EDTA消化，按照密度为4×104个/毫升，0.5毫升每孔接种于24孔培养板(Costar产品)。待其完全贴壁生长后，吸去各孔上清培液，设置“空白对照组”与“实验组”，在空白对照组中加入0.5毫升无血清RPMI-1640培液，在“实验组”中加入0.5毫升酸性细胞培养液。2.5小时用光学显微镜观察细胞生长状态，将“实验组”分为“阴性对照组”与“样品组”，在样品组中加入N-乙酰氨基葡萄糖甲缩醛(或N-乙酰氨基葡萄糖)，保证N-乙酰氨基葡萄糖甲缩醛(或N-乙酰氨基葡萄糖)浓度为450微克/毫升。10小时后，用光学显微镜观察“阴性对照组”与“样品组”的细胞生长状态。
细胞状态观察表明，在“实验组”中加入酸性细胞培养液2.5小时后，细胞生长状况明显不如空白对照组，部分细胞开始出现死亡的迹象。10小时后，“阴性对照组”细胞生长状况很差，大部分细胞死亡；而“样品组”细胞生长状况得到明显好转，接近“空白对照组”。
(4)N-乙酰氨基葡萄糖甲缩醛(或N-乙酰氨基葡萄糖)在酸性培液中调节细胞pH值实验(二)鼠单核巨噬细胞Raw264.7购自美国模式菌种收藏中心(ATCC)，常规保存于含10％胎牛血清，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的DMEM(Gibco产品)培液中，细胞培养箱温度37℃，含5％二氧化碳。取生长良好的细胞，用胰蛋白酶和EDTA消化，按照密度为4×104个/毫升，0.5毫升每孔接种于24孔培养板(Costar产品)。待其完全贴壁生长后，吸去各孔上清培液，设置“空白对照组”与“实验组”，在空白对照组中加入0.5毫升无血清RPMI-1640培液，在“实验组”中加入0.5毫升酸性细胞培养液。0.5小时用光学显微镜观察细胞生长状态，将“实验组”分为“阴性对照组”与“样品组”，在样品组中加入N-乙酰氨基葡萄糖甲缩醛(或N-乙酰氨基葡萄糖)，保证N-乙酰氨基葡萄糖甲缩醛(或N-乙酰氨基葡萄糖)浓度为150微克/毫升。10小时后，用光学显微镜观察“阴性对照组”与“样品组”的细胞生长状态。
细胞状态观察表明，在“实验组”中加入酸性细胞培养液0.5小时后，细胞生长状况明显不如空白对照组，部分细胞开始出现死亡的迹象。10小时后，“阴性对照组”细胞生长状况很差，大部分细胞死亡；而“样品组”细胞生长状况得到明显好转，接近“空白对照组”。
(5)N-乙酰氨基葡萄糖甲缩醛(或N-乙酰氨基葡萄糖)在酸性培液中调节细胞pH值实验(三)人脐静脉血管内皮细胞HUVEC从脐带中分离，具体方法为取新鲜健康的胎儿脐带，灌入5％胶原酶，37℃水浴15-20分钟，用PBS冲洗脐静脉，离心，弃上清，用培养液悬浮细胞，置含10％胎牛血清，10纳克/毫升血管内皮生长因子(VEGF，R&D产品)，100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的DMEM培液中，细胞培养箱温度37℃，含5％二氧化碳，用兔抗人第八因子抗体进行免疫组化鉴定。
用胰蛋白酶和EDTA消化，取第4-7代生长良好的细胞，按照密度为6×104个/毫升，去各孔上清培液，设置“空白对照组”与“实验组”，在空白对照组中加入0.5毫升无血清RPMI-1640培液，在“实验组”中加入0.5毫升酸性细胞培养液。0.5小时用光学显微镜观察细胞生长状态，将“实验组”分为“阴性对照组”与“样品组”，在样品组中加入N-乙酰氨基葡萄糖甲缩醛(或N-乙酰氨基葡萄糖)，保证N-乙酰氨基葡萄糖甲缩醛(或N-乙酰氨基葡萄糖)浓度为350微克/毫升。11小时后，用光学显微镜观察“阴性对照组”与“样品组”的细胞生长状态。
细胞状态观察表明，在“实验组”中加入酸性细胞培养液3小时后，细胞生长状况明显不如空白对照组，部分细胞开始出现死亡的迹象。11小时后，“阴性对照组”细胞生长状况很差，大部分细胞死亡；而“样品组”细胞生长状况得到明显好转，接近“空白对照组”。
权利要求
1.一种甲壳素类物质在制备调节人体酸碱平衡的制品中的应用。
2.根据权利要求1所述的甲壳素类物质在制备调节人体酸碱平衡的制品中的应用，其特征是甲壳素类物质是甲壳素、壳聚糖、甲壳低聚糖、氨基葡萄糖盐类、N-乙酰氨基葡萄糖或N-乙酰氨基葡萄糖甲缩醛。
全文摘要
本发明公开了一种甲壳素类物质在制备调节人体酸碱平衡的制品中的应用。本发明提供了甲壳素类物质的新用途，它具有升高细胞生存环境的pH值，减少酸性环境对细胞体的损害，从而调节机体内环境的酸碱性，维持生物有机体进行正常的新陈代谢的功效。
文档编号A61P3/00GK1771985SQ20051009504
公开日2006年5月17日申请日期2005年10月22日优先权日2005年10月22日
发明者梁双林, 张俊峰申请人:梁双林