金属离子铬和镁参与NAFLD脂代谢调控研究
【摘要】： 随着非酒精性脂肪肝病(NAFLD)发病率逐年上升,已成为21世纪全球重要的公共健康问题之一,探究其病理机制和发掘潜在治疗靶点是目前相关研究的重心。金属离子在细胞功能、信号转导和能量代谢中起到重要作用,参与多种生理活动和疾病发展,是许多脂代谢关键酶的辅基,但它们在NAFLD脂代谢中的调控作用并不完全清楚。三价铬离子是哺乳动物必需微量元素之一,在维持血糖平衡和脂质代谢中起着重要作用,广泛应用于保健品、饲料添加剂和医药行业。有报道其对预防和缓解NAFLD有潜在作用,但分子机制仍不清晰。首先选取SMMC-7721细胞和BALB/c小鼠作为研究对象,用油酸(OA)作为单一外源脂肪酸诱导构建NAFLD细胞模型和小鼠模型,并对NAFLD模型补充三价铬离子。结果显示三价铬离子可以有效改善NAFLD性状。三价铬离子可以有效降低肝细胞和肝脏内甘油三酯和脂肪酸的过量累积,降低肝重、体重和转氨酶ALT、AST含量,降低CD36和DGAT2的过表达,同时稳定小鼠血清中紊乱的炎症因子。在和DGAT2抑制剂、激动剂联合作用时,三价铬离子依然对DGAT2的表达水平起负调控效应,抑制甘油三酯的合成,说明DGAT2可能是三价铬离子参与NAFLD脂代谢调控的重要靶分子。对OA诱导的NAFLD细胞模型和小鼠模型进行金属组分析发现,脂变性的同时均伴随着镁缺乏,外源补充镁离子NAFLD脂代谢紊乱能否得到改善有待证实。镁离子是人体内第二大阳离子,作为辅酶因子参与细胞内600多种酶系统,在能量代谢、细胞增殖和神经传导中有着重要作用,而镁缺乏会造成痉挛、抑郁、高血脂和肥胖等疾病。本文结果显示补充镁离子可以有效缓解NAFLD模型的脂变性:通过油红O染色、TLC和GCMS等方法检测脂类变化发现外源镁离子可以缓解NAFLD模型中甘油三酯以及脂肪酸的过量累积;且外源镁离子可以抑制NAFLD小鼠血清中过高的转氨酶ALT和AST;进一步通过实时荧光定量PCR和Western blot分析相关脂代谢基因发现外源镁离子可以降低OA引起的CD36和DGAT2过量表达,推测镁离子通过降低脂肪酸转运蛋白CD36表达来降低肝脏摄取OA,同时通过降低甘油三酯合成限速酶DGAT2表达来降低肝脏内甘油三酯合成。已有研究发现炎症因子紊乱可以导致并加重NAFLD发病程度,促炎因子和抗炎因子之间的平衡,可能决定了 NAFLD的进展,本文通过ELISA分析NAFLD小鼠血清炎症因子变化,结果显示镁离子可以降低促炎因子(IL-1β、TNF-α和IL-12)含量并升高抗炎因子(IL-10)含量,改善NAFLD小鼠炎症反应。此外,用ICP-AES检测NAFLD细胞和小鼠模型金属组,结果显示外源镁离子可以有效缓解NAFLD模型铁负载症状,说明镁离子可以通过改善铁负载进而起到改善NAFLD的性状。镁离子对NAFLD缓解作用机制研究表明,外源OA下调了 NAFLD细胞模型镁离子转运基因PRL3和CNNM3的表达水平,同时降低肝细胞内镁离子浓度;相反,通过重组质粒超表达PRL3和CNNM3可以恢复胞内镁离子含量,且PRL3响应镁离子对DGAT2的调控。镁离子响应基因PRL3是否可以通过调控DGAT2的表达影响甘油三醋合成?本文利用重组质粒转染和siRNA干扰技术对通路上各信号蛋白进行超表达或沉默,结果表明PRL3作为上游基因作用于PI3K/AKT/mTOR和mTOR/Lipin1/SREBP1信号通路,且SREBP1调控DGAT2的表达。在镁离子缓解NAFLD细胞模型脂积累同时,添加PRL3抑制剂和mTOR抑制剂进行验证,Western blot结果表明镁离子经由PRL3/AKT/mTOR和mTOR/Lipin1/SREBP1作用于DGAT2的表达,并经由此通路影响甘油三酯的合成。SREBP1作为脂代谢基因调控转录因子,其转录调控区域克隆超表达载体可以下调DGAT2表达,且siRNA-SREBP1上调DGAT2表达。启动子数据库检索发现DGAT2启动子区域存在SREBP1结合位点(5'-ATCACCCCAC-3'),荧光素酶报告基因检测发现SREBP1负调控DGAT2基因启动子转录活性,EMSA和ChIP实验结果证实SREBP1蛋白和DGAT2启动子DNA在细胞外和内存在结合作用。同时镁离子作为辅助因子参与SREBP1蛋白和DGAT2启动子的结合过程。综上所述,三价铬离子和镁离子均可以降低OA诱导的NAFLD小鼠模型中的脂累积、肝重、体重和转氨酶,并稳定紊乱的脂代谢基因和炎症因子;镁离子还起到改善铁负载和镁缺乏的作用。镁离子参与NAFLD脂代谢细胞调控机制结果显示:镁离子经由PRL3/AKT/mTOR 和 mTOR/Lipin1/SREBP1 通路作用于 DGAT2 的表达且参与 SREBP1对DGAT2转录调控过程。总之,通过本论文的研究,证实了金属离子在NAFLD脂代谢的重要调控作用,并提出了DGAT2作为NAFLD潜在治疗靶点的可能性。
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
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