姜黄素与人参果提取物对间充质干细胞成骨分化的影响与成骨不全模型的作用
姜黄素与人参果提取物对间充质干细胞成骨分化的影响与成骨不全模型的作用
【摘要】： 骨骼是一种代谢十分活跃的组织,一直处于骨形成和骨吸收的动态平衡中。成骨细胞主导的骨形成和破骨细胞主导的骨吸收共同维持骨稳态,任何一方的失调均可导致骨骼疾病的发生,如骨质疏松、肾性骨病、内分泌骨病、成骨不全(Osteogenesis Imperfecta,OI)等。骨骼疾病可以引起骨痛、骨折、骨骼畸形等,严重影响患者的健康状况和日常生活。调节骨稳态的药物主要有骨吸收抑制剂和骨形成促进剂,其中骨吸收抑制剂居多。重组人甲状旁腺激素是目前唯一上市的骨形成促进剂,但因有致癌风险,限制了其在临床上的应用。近年来,来源于中药和水果等的天然提取物因具有来源广、疗效确切、不良反应轻等优势,在骨骼疾病中的应用日益增多。因此,本研究选择中药制剂姜黄素和人参果(Solanum muricatum Ait,SM)提取物作为观察对象,探讨两者对间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)成骨分化的影响以及SM提取物在OI模型中的作用及可能机制。第一部分目的探讨姜黄素与SM分别对脂肪来源间充质干细胞(Adipose-derived Mesenchymal Stem Cells,a MSCs)与骨髓间充质干细胞(bone marrowmesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化的影响,并探讨其机制是否与无翅基因相关整合位点(Wingless gene-related integration site,Wnt)/β-连环蛋白(β-catenin)信号通路相关。方法1姜黄素对过氧化氢诱导的a MSCs成骨分化及Wnt/β-catenin信号通路的影响采集人脂肪组织,分离a MSCs并用成骨分化培养基诱导分化。采用流式细胞仪测定a MSCs的表面标志物。用过氧化氢和姜黄素分别处理细胞,测定细胞活力、谷胱甘肽(Glutathione,GSH)水平、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量、碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)活性、钙含量,并进行茜素红硫酸盐(Alizarin Red Sulfate,ARS)染色。采用反转录聚合酶链反应(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)测定骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)、1型胶原蛋白(Collagen1,Col 1)、骨保护素(Osteoprotegerin,OPG)和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)m RNA表达。用Wnt抑制剂(Dickkopf1,DKK1)干预a MSCs后,测定细胞中β-catenin、Cyclin D1、糖原合酶激酶-3β(Glycogen Synthase Kinase-3β,GSK-3β)、p-GSK-3β和C-myc的蛋白表达。2 SM对BMSCs的分化及Wnt/β-catenin信号通路的影响采用植物化学方法制备SM提取物,并对SM提取物进行鉴定。用成骨分化培养基和SM提取物处理BMSCs,通过测定细胞活力和乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH)释放量评价SM提取物的细胞毒性。将BMSCs在成骨分化培养基中分别培养12 d和20 d,然后分别行ALP和ARS染色。采用RT-PCR法和Western Blot法测定细胞中骨形态发生蛋白4(Bone Morphogenetic Protein 4,BMP4)、成骨特异性转录因子(Runt-related Transcription Factor 2,Runx2)、β-catenin、Cyclin D1 m RNA和蛋白表达。结果1姜黄素对a MSCs成骨分化的影响1.1获得的a MSCs表面的CD29、CD44、CD105阳性,CD34、CD45阴性。1.2与对照组比较,在0~2 mmol/L范围内,过氧化氢剂量依赖性诱导a MSCs活力降低;50和100μmol/L的姜黄素引起a MSCs活力明显降低。0~20μmol/L的姜黄素以剂量依赖性方式阻止过氧化氢诱导的a MSCs活力降低,而50和100μmol/L的姜黄素与过氧化氢协同降低a MSCs活力。1.3与对照组比较,0.2~2 mmol/L过氧化氢和50、100μmol/L姜黄素明显降低a MSCs中的ALP活性和钙含量,5~20μmol/L姜黄素明显升高a MSCs中的ALP活性和钙含量(P<0.05)。与过氧化氢组比较,过氧化氢+20μmol/L姜黄素组的ALP活性和钙含量明显增加(P<0.05)。1.4与对照组比较,0.2 mmol/L过氧化氢明显诱导a MSCs中OPN、Col 1m RNA表达降低,诱导a MSCs中核因子κB受体活化因子配体(Receptor Activator of Nuclear Factor-κB Ligand,RANKL)m RNA表达升高(P<0.05);20μmol/L姜黄素明显诱导a MSCs中OPN、Col 1 m RNA表达升高(P<0.05)。与过氧化氢组比较,过氧化氢+20μmol/L姜黄素组的OPN、Col 1 m RNA表达明显降低,RANKL m RNA表达明显升高(P<0.05)。1.5与对照组比较,0.2 mmol/L过氧化氢明显诱导a MSCs中GSH水平和SOD活性降低,MDA含量增加(P<0.05);20μmol/L姜黄素明显诱导a MSCs中GSH水平和SOD活性升高,MDA含量减少(P<0.05)。与过氧化氢组比较,过氧化氢+20μmol/L姜黄素组的GSH水平和SOD活性明显升高,MDA含量明显减少(P<0.05)。1.6与对照组比较,0.2 mmol/L过氧化氢明显诱导a MSCs中β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白表达明显下调,p-GSK-3β和GSK-3β蛋白表达明显上调(P<0.05);20μmol/L姜黄素诱导a MSCs中β-catenin的蛋白表达明显上调,p-GSK-3β和GSK-3β的蛋白表达明显下调(P<0.05)。与过氧化氢组比较,过氧化氢+20μmol/L姜黄素组的β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白表达明显上调,p-GSK-3β和GSK-3β蛋白表达明显下调(P<0.05)。1.7与对照组比较,Wnt3a和Wnt3a+姜黄素诱导a MSCs中β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白表达明显上调(P<0.05),p-GSK-3β和GSK-3β蛋白表达明显下调(P<0.05),但两组干预方式的作用无明显区别(P>0.05);DKK1和DKK1+姜黄素组的β-catenin、C-myc和Cyclin D1蛋白表达明显下调(P<0.05),p-GSK-3β的蛋白表达明显上调(P<0.05)。与DKK1组比较,DKK1+姜黄素组的C-myc和Cyclin D1蛋白表达明显上调(P<0.05)。1.8与过氧化氢组比较,过氧化氢+Wnt3a和过氧化氢+Wnt3a+姜黄素组的ALP活性和钙含量明显增加(P<0.05);与过氧化氢+姜黄素组比较,过氧化氢+姜黄素+DKK1组的ALP活性和钙含量明显降低(P<0.05)。2 SM提取物对BMSCs成骨分化的影响2.1 SM提取物中最主要的成分是总酚酸和总黄酮,含量分别为(1355.0±171.0)mg/100 g和(931.0±108.0)mg/100 g。2.2用50~500μg/m L的SM提取物处理BMSCs 1 d未引起细胞活力和LDH释放量明显变化,但用500μg/m L的SM提取物处理BMSCs 3 d和5 d,细胞活力明显降低,LDH释放量明显增加(P<0.05)。2.3与对照组比较,100、250μg/m L SM提取物组的ARS和ALP阳性染色率、矿化结节数量、ALP活性、OPN m RNA和Col 1 m RNA表达明显增加(P<0.05)。2.4与对照组比较,100、250μg/m L SM提取物组的Runx2和BMP4 m RNA表达明显增加,250μg/m L SM提取物组的β-catenin和Cyclin D1 m RNA表达增加(P<0.05)。2.5与对照组比较,SM提取物组的ALP活性、矿化结节数量明显增加;与SM提取物组比较,SM提取物+DKK1组和SM提取物+noggin组的ALP活性和矿化结节数量明显减少(P<0.05)。2.6与对照组比较,SM提取物组的Runx2、BMP4、β-catenin和Cyclin D1m RNA和蛋白表达明显增加;与SM提取物组比较,SM提取物+DKK1组的β-catenin和Cyclin D1 m RNA表达和SM提取物+noggin组的Runx2、BMP4 m RNA表达明显减少(P<0.05)。结论1低剂量姜黄素可通过抗氧化和激活Wnt/β-catenin信号通路减轻过氧化氢诱导的a MSCs氧化应激状态,从而促进细胞成骨分化。2 SM提取物可通过激活Wnt和BMP信号通路促进BMSCs成骨分化。第二部分目的探讨SM提取物对OI小鼠骨质的影响,并分析SM提取物对骨胶原蛋白的影响,以进一步证实SM提取物的成骨分化特性。方法建立小鼠OI模型,利用微计算机断层扫描(Micro Computed Tomography,micro CT)分析OI小鼠椎骨和股骨干骺端的骨量和微结构数据,应用拉曼光谱法检测SM提取物处理后骨矿物质和基质组成的变化,用酶免疫测定法(Enzyme Immunoassay,EIA)检测胶原合成标志物Ⅰ型前胶原氨基端前肽(N-Terminal Propeptide of TypeⅠProcollagen,PINP)和胶原降解标志物胶原蛋白羧基端肽(Collagen Carboxyl Terminal Peptide,CTX)。结果SM提取物能够改善OI小鼠椎体和股骨的骨体积分数(Bone Volume over Total Volume,BV/TV)、骨小梁数量(Trabecular Number,Tb N)、骨小梁厚度(Trabecular Thickness,Tb Th)、骨连接密度(Connectivity Density,Conn D)等骨小梁微结构参数。SM提取物能够改善OI小鼠矿物质比蛋白质(PO4/CH2)、矿物质比胶原(PO4/amide I)、羟脯胺酸含量。SM提取物能够上调PINP和下调CTX表达。结论SM提取物可以明显改善OI小鼠的症状,其具有成为骨形成和骨重塑新药的潜力。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
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