用鲍曼不动杆菌降解绿茶茶渣的方法与流程
技术背景
作为茶叶的发源地之一，我国毋庸置疑是茶叶产量大国，2017年，我国的绿茶产量已超过了160万吨，并依旧保持每年都增加的趋势。这么多的茶叶产量也意味着非常多的茶叶副产物-茶渣的产生，依据茶叶的产量推算，每年至少有40～50万吨的废弃茶渣产生。
在绿茶的冲泡及饮用过程中，只有有限的水溶性物质成分溶于茶汤。用于生产速溶茶的绿茶，茶饮料和功能成分的提取物只达到了茶叶干重的30％，而剩下的70％的干重就是茶渣。而这70％的干重中依然含有较多的营养物质(例如茶多酚、氨基酸、粗纤维、粗蛋白等)。因此综合开发绿茶资源、充分利用茶叶中的天然有效成分是时代发展的必然趋势，具有巨大的市场潜力。
绿茶茶渣作为茶叶副产物，其中含有大量未利用的有效成分，但我国目前对绿茶茶渣的回收利用仍处在初步研究阶段，这意味着绿茶中大量有效成分将成为废弃物，付之东流。因此，若能研究出一种简单的方法使茶叶快速分解，使其中的有效成分快速、大量地释放出来，将有利于茶渣的循环再利用，并对社会的可持续发展具有重要意义。
本研究从分解茶渣出发，旨在通过发明一种适宜绿茶茶渣降解菌的培养方法，通过菌株的快速降解，为利用生物法获得绿茶茶渣中保留的有效成分，开发茶叶废渣再利用的研究奠定技术基础。
目前国内外关于微生物降解茶渣的报道较少，对茶渣的研究多集中在生产复合肥和茶渣成分提取等方向。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供用鲍曼不动杆菌降解绿茶茶渣的方法，从而可以快速的降解茶渣。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是，用鲍曼不动杆菌降解绿茶茶渣的方法，其特征在于包含以下步骤：
1.种子培养基的制备
称取蔗糖7g，蛋白胨5g，浸酵母粉6g，nacl3g，加入少量无菌去离子水充分溶解，然后继续添加无菌去离子水至1l配制种子培养基，将ph调至7，加热溶解后于高温高压灭菌锅中115℃灭菌30min，随后在无菌操作环境下分装至各个培养皿冷却，每个培养皿分装20ml种子培养基。
2.种子培养基接入菌种
在无菌操作环境下，将活化后传代培养的不动杆菌属的鲍曼不动杆菌[atcc19606]标准菌种，用无菌移液枪接入冷却后的种子培养基，并在种子培养基上分部均匀。
3.菌的培养
将接有菌株的种子培养基密封后放入温控摇床中以恒温37℃，180rpm/min培养12h。
4.菌液接入茶渣
将接有菌液并培养后的种子培养基取出，将培养基中的菌株与种子培养基用无菌移液枪调和均匀成为混合液体菌液，在无菌操作环境下，用无菌移液枪向无菌绿茶湿茶渣中接入培养后的混合液体菌液，茶渣与菌液接入比例为3g/ml。密封后重新置于温控摇床中以室温培养72h。
本发明进一步说明：
1.茶渣降解验证
设置空白对照组。在无菌操作环境下，用无菌移液枪向同一等级的无菌绿茶湿茶渣中接入不含鲍曼不动杆菌标准菌种的种子培养基，茶渣与菌液接入比例为3g/ml，密封后重新置于温控摇床中以室温培养72h。
在扫描电镜放大500倍数下观察添加菌株与否后降解茶渣叶片表面的结构变化，结果表明：空白对照组没有接菌的茶渣表面有完整的、均匀分布的气孔，且相邻气孔之间排列紧密。而接入了有菌培养基的茶渣在经培养的菌株发酵后，茶叶表面的气孔被扩大，气孔边缘受到破坏，证明在相同的时间里，利用鲍曼不动杆菌可快速降解绿茶茶渣。
附图说明：图1为空白对照
图2为加菌株降解后茶叶发酵液外观图
图3为空白对照扫描电镜放大500倍数下结构图
图4为加菌株降解后扫描电镜放大500倍数下茶叶结构图
具体实施方式：
实施例1：
1.种子培养基的制备
称取蔗糖7g，蛋白胨5g，浸酵母粉6g，nacl3g，加入少量无菌去离子水充分溶解，然后继续添加无菌去离子水至1l配制种子培养基，将ph调至7，加热溶解后于型号为ym75cm的高温高压灭菌锅中115℃灭菌30min，随后在无菌操作环境下分装至各个培养皿冷却，每个培养皿分装20ml种子培养基。
2.种子培养基接入菌种
在无菌操作环境下，将活化后传代培养的不动杆菌属的鲍曼不动杆菌[atcc19606]标准菌种，用无菌移液枪接入冷却后的种子培养基，并在种子培养基上分部均匀。
3.菌的培养
将接有菌株的种子培养基密封后放入型号为xq-200bd温控摇床中以恒温37℃，180rpm/min培养12h。
4.菌液接入茶渣
将接有菌液并培养后的种子培养基取出，将培养基中的菌株与种子培养基用无菌移液枪调和均匀成为混合液体菌液，在无菌操作环境下，用无菌移液枪向3g特级碧螺春无菌湿茶渣中接入1ml培养后的混合液体菌液，密封后重新置于温控摇床中以室温培养72h。
5.茶渣降解验证
设置空白对照组。在无菌操作环境下，用无菌移液枪吸取1ml没有接菌的种子培养基，加入到3g特级碧螺春茶叶的无菌湿茶渣中，密封后重新置于温控摇床中以室温培养72h。
72h后同时观察空白对照与发酵液外观变化以及空白对照与发酵液在电镜观察下的结构变化，发现接入加有鲍曼不动杆菌[atcc19606]标准菌种混合培养基的碧螺春茶渣已被分解，电镜下碧螺春茶渣表面的气孔被扩大，气孔边缘受到破坏。而对照空白组中的茶渣则还未开始分解且电镜下的碧螺春茶渣表面有完整的、均匀分布的气孔，且相邻气孔之间排列紧密。
实施例2：
1.种子培养基的制备
称取蔗糖7g，蛋白胨5g，浸酵母粉6g，nacl3g，加入少量无菌去离子水充分溶解，然后继续添加无菌去离子水至1l配制种子培养基，将ph调至7，加热溶解后于型号为ym75cm的高温高压灭菌锅中115℃灭菌30min，随后在无菌操作环境下分装至各个培养皿冷却，每个培养皿分装20ml种子培养基。
2.种子培养基接入菌种
在无菌操作环境下，将活化后传代培养的不动杆菌属的鲍曼不动杆菌[atcc19606]标准菌种，用无菌移液枪接入冷却后的种子培养基，并在种子培养基上分部均匀。
3.菌的培养
将接有菌株的种子培养基密封后放入型号为xq-200bd温控摇床中以恒温37℃，180rpm/min培养12h。
4.菌液接入茶渣
将接有菌液并培养后的种子培养基取出，将培养基中的菌株与种子培养基用无菌移液枪调和均匀成为混合液体菌液，在无菌操作环境下，用无菌移液枪向3g一级龙井无菌湿茶渣中接入1ml培养后的混合液体菌液，密封后重新置于温控摇床中以室温培养72h。
5.茶渣降解验证
设置空白对照组。在无菌操作环境下，用无菌移液枪吸取1ml没有接菌的种子培养基，加入到3g一级龙井茶叶的无菌湿茶渣中，密封后重新置于温控摇床中以室温培养72h。
72h后同时观察空白对照与发酵液外观变化以及空白对照与发酵液在电镜观察下的结构变化，发现接入加有鲍曼不动杆菌[atcc19606]标准菌种混合培养基的龙井茶渣已被分解，电镜下龙井茶渣表面的气孔被扩大，气孔边缘受到破坏。而对照空白组中的茶渣则还未开始分解且电镜下的龙井茶渣表面有完整的、均匀分布的气孔，且相邻气孔之间排列紧密。
实施例3：
1.种子培养基的制备
称取蔗糖7g，蛋白胨5g，浸酵母粉6g，nacl3g，加入少量无菌去离子水充分溶解，然后继续添加无菌去离子水至1l配制种子培养基，将ph调至7，加热溶解后于型号为ym75cm的高温高压灭菌锅中115℃灭菌30min，随后在无菌操作环境下分装至各个培养皿冷却，每个培养皿分装20ml种子培养基。
2.种子培养基接入菌种
在无菌操作环境下，将活化后传代培养的不动杆菌属的鲍曼不动杆菌[atcc19606]标准菌种，用无菌移液枪接入冷却后的种子培养基，并在种子培养基上分部均匀。
3.菌的培养
将接有菌株的种子培养基密封后放入型号为xq-200bd温控摇床中以恒温37℃，180rpm/min培养12h。
4.菌液接入茶渣
将接有菌液并培养后的种子培养基取出，将培养基中的菌株与种子培养基用无菌移液枪调和均匀成为混合液体菌液，在无菌操作环境下，用无菌移液枪向3g二级无锡毫茶无菌湿茶渣中接入1ml培养后的混合液体菌液，密封后重新置于温控摇床中以室温培养72h。
5.茶渣降解验证
设置空白对照组。在无菌操作环境下，用无菌移液枪吸取1ml没有接菌的种子培养基，加入到3g二级无锡毫茶茶叶的无菌湿茶渣中，密封后重新置于温控摇床中以室温培养72h。
72h后同时观察空白对照与发酵液外观变化以及空白对照与发酵液在电镜观察下的结构变化，发现接入加有鲍曼不动杆菌[atcc19606]标准菌种混合培养基的无锡毫茶茶渣已被分解，电镜下无锡毫茶茶渣表面的气孔被扩大，气孔边缘受到破坏。而对照空白组中的茶渣则还未开始分解且电镜下的无锡毫茶茶渣表面有完整的、均匀分布的气孔，且相邻气孔之间排列紧密。
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