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一种番石榴叶及番石榴叶总黄酮的新用途的制作方法

泰然健康网
2024-12-12 15:57

本发明涉及医药领域，具体的说，本发明涉及一种防治胰腺炎的中药及其总黄酮提取物。

背景技术：

胰腺炎可以为急性(新出现、短期)或慢性(持续、长期)。

急性胰腺炎(ap)是导致显著发病率和死亡率的常见疾病。其发病早期会发生器官功能衰竭和全身炎症反应综合征，晚期会出现坏死组织的感染。目前，急性胰腺炎的治疗和预后仍具有挑战性，具有高病死率、高致残率、高额费用的特点。在对胰腺的损伤开始之后急性胰腺炎通常立即开始，发作通常非常轻微，轻微发作可持续较短时间，并通常在胰腺恢复其正常状态时完全复原，急性胰腺炎的反复发作会形成慢性胰腺炎。

慢性胰腺炎(cp)，主要临床表现为反复发作的上腹部疼痛和胰腺内、外分泌功能不全，且发病率呈逐年增高的趋势，严重危害人类健康。不仅如此，临床上反复发作、持续进展的cp有相当的危险性发展成为胰腺癌(约10％)，胰腺癌预后极差，在总癌症死亡率中占第8位，发达国家高居第4位，且大部分病人在确诊后一年内死亡。迄今，cp的发病机理、病理生理和临床过程仍不十分清楚，尚无理想的治疗方案。研究发现，cp虽病因各异，但病理学改变相似，即持续进展的慢性炎症最终导致胰腺腺泡和胰岛细胞出现不可逆性损害，并逐渐被纤维组织所取代，致使胰腺内、外分泌功能显著障碍。胰腺纤维化是cp的重要病理过程，可导致胰腺功能性组织丧失、胰管狭窄或扩张、腺泡细胞萎缩、胰管结石以及炎症细胞浸润等后果。抑制胰腺纤维化的发展可有效缓解cp症状并成为防止cp恶变的有效手段。但胰腺纤维化发病机制复杂，目前尚无有效抑制胰腺纤维化的药物。

中药治疗具有多层次、多靶点、毒副作用小等特点，对于防治慢性疾病有其独特优势。番石榴叶是一种抗氧化、抗痉挛、抗过敏、抗炎、抗糖尿病的中药，提取物中主要成分为鞣质、三萜、挥发油、多糖和酮类化合物等，其中黄酮类是主要的生物活性成分。现有技术主要针对番石榴叶总黄酮的降糖作用，也有部分文献报道了其抗肿瘤活性，但对于胰腺炎的防治作用尚未见相关文献及专利。

技术实现要素：

本发明第一个目的在于公开了番石榴叶的新用途。

本发明第二个目的在于公开番石榴叶总黄酮的新用途。

番石榴叶总黄酮可以按照现有技术制备，本发明也同时提供了一种优化的提取和检测方法：在单因素试验的基础上，以提取时间、料液比、乙醇用量为自变量，金丝桃苷、槲皮素-3-o-β-d-吡喃阿拉伯糖苷、槲皮素-3-o-α-l-呋喃阿拉伯糖苷和浸出物得率的综合评分为因变量，采用box-behnken设计-响应面法优化番石榴叶总黄酮回流提取工艺并进行验证试验。优化的提取工艺稳定可行、检测方法稳定、质量可控。

经药理试验证明，番石榴叶总黄酮具有防治急慢性胰腺炎的作用。与正常组相比，雨蛙素注射后胰腺损伤加重(p＜0.001)，caspase-1、nlrp3、α-sma、il-1β、il-18水平升高(p＜0.01)。天狼星红染色显示胰腺组织细胞周围胶原ⅰ(colⅰ)、胶原ⅲ(colⅲ)含量较正常组升高(p＜0.001)。与模型组相比，oxatp组及tfpgl低、高剂量组炎症损伤及纤维化程度均减轻，表现为天狼星红染色程度减轻(p＜0.05)，caspase-1、nlrp3、α-sma、il-1β、il-18水平均降低(p＜0.05)。

本发明番石榴叶总黄酮还可以按常规的制剂工艺制成药剂学可接受的任意常规剂型，例如胶囊剂、片剂、颗粒剂、散剂、口服液、丸剂等制剂。为使上述剂型能够实现，需在制备这些剂型时加入药学可接受的辅料，例如：填充剂、崩解剂、润滑剂、助悬剂、粘合剂、甜味剂、矫味剂、防腐剂、基质等。填充剂包括：淀粉、预胶化淀粉、乳糖、甘露醇、甲壳素、微晶纤维素、蔗糖等；崩解剂包括：淀粉、预胶化淀粉、微晶纤维素、羧甲基淀粉钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、低取代羟丙纤维素、交联羧甲基纤维素钠等；润滑剂包括：硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉、二氧化硅等；助悬剂包括：聚乙烯吡咯烷酮、微晶纤维素、蔗糖、琼脂、羟丙基甲基纤维素等；粘合剂包括，淀粉浆、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等；甜味剂包括：糖精钠、阿斯帕坦、蔗糖、甜蜜素、甘草次酸等；矫味剂包括：甜味剂及各种香精；防腐剂包括：尼泊金类、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸及其盐类、苯扎溴铵、醋酸氯乙定、桉叶油等；基质包括：peg6000，peg4000，虫蜡等。

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

附图说明

图1番石榴叶总黄酮提取物(a)和对照品(b)高效液相色谱图

图2番石榴叶总黄酮及oxatp治疗前后胰腺损伤及纤维化组织学评价

图3苦味酸天狼星红染色评价胰腺纤维化(上图为偏光镜下视野，下图为光镜下视野)

图4免疫组化检测α-sma、nlrp3和caspase-1在胰腺组织中的表达(×200)

具体实施方式

实施例1番石榴叶总黄酮的提取及含量测定

采用乙醇回流提取-减压回收试剂-浓缩-过滤-石油醚处理-乙酸乙酯萃取等步骤提取。tfpgl含量测定以芦丁为标准品测定吸光值，以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。紫外分光光度法测量被检样品500nm处吸光度(芦丁标准品在500nm处有强吸光值，设为测定波长)，代入标准曲线回归方程计算得出总黄酮含量为19.8％。

实施例2番石榴叶总黄酮的急性毒性

1.实验方法：

试验设计给药组及空白对照组，每组24只动物，雌雄各半。给药组给药剂量为22.32g/kg，给药容积40ml/kg灌胃给药。对照组灌胃给予等体积饮用水。

每日观察并记录小鼠的外观、精神状态、呼吸、皮肤被毛、粪尿、眼、耳、鼻、口腔、生殖器等一般情况及其它中毒表现和死亡情况。每周测定小鼠体重、摄食量一次，连续观察14天。

2.实验结果：

一般状况及死亡情况观察：给药后直至第14天，各动物精神及行为活动状况良好、皮肤被毛清洁、大小便正常，体重增长正常，摄食量未见异常，亦未见其他毒性反应症状。观察结束后大体解剖未见脏器明显异常。

体重：雌、雄小鼠在各时间点体重与对照组雌、雄小鼠体重相比，差异无统计学意义(p>0.05)，认为番石榴叶总黄酮经口灌胃给药对小鼠体重无明显影响。

实施例3多指标效应面法优选番石榴叶总黄酮酶辅助提取工艺

1.色谱条件及方法：

色谱柱为安捷伦eclipsexdb-c18(4.6mm×250mm，5μm)；a(甲醇％)，b(0.2％磷酸水溶液％)；梯度洗脱，0～20.00min，37％a；20.01～35.00min，70％a；体积流量1ml/min；柱温为35℃；检测波长：360nm。精密吸取供试品溶液10μl，测定供试品溶液中金丝桃苷、槲皮素-3-o-β-d-吡喃阿拉伯糖苷、槲皮素-3-o-α-l-呋喃阿拉伯糖苷峰面积，计算成分含量，结合这3个成分色谱峰面积占总峰面积的百分比例，折算出供试品溶液中番石榴叶总黄酮的含量。

总黄酮含量＝总黄酮含量(mg/g)＝3种黄酮苷质量分数总和/3种黄酮苷色谱峰面积百分比总和×100％

色谱图见图1。

2.单因素试验

酶用量的考察：取番石榴叶粉末1.0g，精密称定，提取温度为30℃，提取时间为30min，料液比为1:25(g/ml)，乙醇浓度为40％，酶用量分别为0，0.1％，0.2％，0.5％，1.0％，1.5％，2.0％条件下提取，测定总黄酮的含量，结果分别为4.17mg/g，4.39mg/g，4.86mg/g，5.24mg/g，8.48mg/g，6.48mg/g，5.92mg/g。结果可知，总黄酮含量随酶用量的增加先升高后降低，当酶用量为1.0％时总黄酮的含量最高。因此，选择酶的最佳用量为1.0％。

提取温度的考察：取番石榴叶粉末1.0g，精密称定，酶用量为0.5％，提取时间为30min，料液比为1:25(g/ml)，乙醇浓度为40％，分别在20，30，40，50，60，70℃的条件下进行提取，测定总黄酮的含量。结果分别为5.04mg/g，5.24mg/g，6.07mg/g，6.04mg/g，5.13mg/g，3.56mg/g。结果显示，随着提取温度的升高，总黄酮含量升高明显，在提取温度为40℃时，总黄酮的含量达到了最大，提取温度继续升高，总黄酮的含量变化趋于平缓。因而选择提取温度为40℃。

提取时间的考察：取番石榴叶粉末1.0g，精密称定，酶用量为0.5％，提取温度为30℃，料液比为1:25(g/ml)，乙醇浓度为40％，分别在15，30，45，60，75min时间内进行提取，测定总黄酮的含量。结果分别为4.60mg/g，5.24mg/g，4.33mg/g，4.19mg/g，4.85mg/g。结果可知，随着提取时间的延长，总黄酮含量升高，在30min时达到最高，之后总黄酮的含量有所降低，可能是由于超声时间过长对酶的活性有所影响。故确定提取时间为30min。

乙醇体积分数的考察：取番石榴叶粉末1.0g，精密称定，酶用量为0.5％，酶解温度为30℃，提取时间为30min，料液比为1:25(g/ml)，乙醇体积分数分别为30％，40％，50％，60％，70％条件下进行提取，测定总黄酮的含量。结果分别为5.48mg/g，5.24mg/g，8.47mg/g，6.27mg/g，4.83mg/g。随着乙醇浓度的提高，总黄酮含量先升高，在乙醇体积分数50％时总黄酮的含量最高，随着乙醇体积分数的继续升高色谱峰的峰形变差且峰面积降低。因此，选择提取乙醇体积分数为50％。

3.效应面设计试验：

试验设计方案与结果测定：以单因素试验的结果为基础，根据box-behnken试验设计原理，选取影响较大的因素，提取时间(a/min)、酶用量(b/％)以及乙醇体积分数(c/％)为自变量。因素与水平见表2，提取工艺参数考察试验安排及结果见表3。

模型拟合与效应面分析：以金丝桃苷量(y1)、槲皮素-3-o-β-d-吡喃阿拉伯糖苷量(y2)、槲皮素-3-o-α-l-呋喃阿拉伯糖苷量(y3)，进行加权综合评分(od)，计算od值，od＝(1/3y1/y1max+1/3y3/y3max+1/3y2/y2max)×100，其中y1max、y2max、y3max为相应成分量的最大值。

以综合评分od值为响应值，采用design-expert.v7.0.0软件对果进行回归分析。结合操作的可行性，最优工艺定为提取时间34min，酶用量0.93％，乙醇体积分数52％。

实施例4番石榴叶总黄酮对急性胰腺炎的炎症反应

1.方法

首先建立雨蛙素致急性胰腺炎小鼠模型，观察番石榴叶总黄酮对模型的治疗作用，是否能改善急性胰腺炎模型动物的胰腺炎症反应，降低酶活性。动物：c57bl/6小鼠，体重大约20±2g；随机分成三个实验组别：空白对照组，急性胰腺炎模型组及番石榴叶总黄酮组，每组10只(n＝10)。急性胰腺炎模型采用腹腔注射雨蛙素的方式诱导，雨蛙素溶于0.9％生理盐水中，浓度为5μg/ml。向急性胰腺炎组及番石榴叶总黄酮组每小时注射一针雨蛙素，连续注射6针，每针50μg/kg体重。空白对照组注射等剂量的生理盐水。造模前三天开始番石榴叶总黄酮。最后一针雨蛙素注射完成后一小时，将所有小鼠摘眼球取血，解剖后快速收取肠道、胰腺等样品，迅速保存到液氮中，后转移到-80℃冰箱。

1.1血清淀粉酶测定

采取小鼠全血后室温放置30min使血液凝结，随后4℃下3000g离心10min，吸取上清并于-80℃存放。采用碘-淀粉显色法测定血清淀粉酶水平：血清样品与预热的底物反应液在37℃孵育7.5min向混合物中加入碘液和双蒸水，使用分光光度计测量吸光度。计算血清淀粉酶活性(udl)。

1.2血清脂肪酶的测定

采用elisa法测定小鼠血清中的脂肪酶水平，与对照组相比，模型组血清脂肪酶水平显著上升，而造模前喂饲了番石榴叶总黄酮的样品组与模型组相比则有显著下降，与对照组接近。

1.3胰腺组织水肿程度测定

胰腺的水肿程度通过新鲜胰腺样本重量(湿重)跟干燥后胰腺样本重量(干重)的比值进行衡量。刚取出的新鲜的胰腺组织剪取一部分，剔除脂肪，滤纸吸拭胰腺组织表面水分，分析天平称量湿重。将胰腺组织置80℃烘箱中烘烤脱水，48h后分析天平称量干重。计算胰腺组织湿干重比值：

胰腺组织湿干重比率＝胰腺湿重-胰腺干重胰腺湿重×100％

1.4胰腺组织髓过氧化物酶活性测定

过氧化物酶(myeloperoxidase，mpo)是中性粒细胞的激活标志及功能标志，在免疫学上常用mpo来表征中性粒细胞的浸润情况。mpo在每个中性粒细胞中的量为定值，约占细胞干重的5％，该酶具有还原性，利用这一特性测定mpo酶的活性。供氢体复合物经mpo酶还原后产生黄色化合物，于460nm波长处通过比色测定吸光度，计算出此产物的产量，从而推算出mpo的活力。

2.结果

番石榴叶总黄酮对急性胰腺炎的炎症反应的结果见表1。

表1番石榴叶总黄酮对急性胰腺炎的炎症反应

注：与正常对照组比，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；与模型组相比，#p＜0.05，##p＜0.01，###p＜0.001。

实施例5番石榴叶总黄酮对慢性胰腺炎小鼠纤维化的影响

造模：将50只c57bl/6小鼠随机均分为正常组、模型组、oxatp组(15μg·kg-1·d-1)、tfpgl低剂量组(0.186g·kg-1·d-1)、tfpgl高剂量组(0.372·kg-1·d-1)。后四组小鼠均采用反复腹腔注射雨蛙素的方法制备慢性胰腺炎小鼠模型，单次注射剂量为50μg·kg-1，溶于200μl的生理盐水，1次/h，6次/d，每周一、三、五注射，连续注射6周。

给药剂量：在最后一次注射雨蛙素后，oxatp组、tfpgl低、高剂量组小鼠分别予以2周oxatp(15μg·kg-1·d-1，溶于200μl的生理盐水)腹腔注射及tfpgl(0.186、0.372g·kg-1·d-1)灌胃。对照组动物在8周研究期间注射等量的生理盐水，注射时间及次数同模型组。最后一次注射完成24h后，将所有小鼠脱颈处死，剪取部分胰腺组织置于福尔马林用于苏木精-伊红染色、天狼星红苦味酸染色及免疫组化实验，另一部分新鲜组织用于酶联免疫吸附实验。

1.小鼠胰腺组织苏木精-伊红(he)染色及胰腺慢性炎症纤维化评估：

福尔马林溶液固定组织24h后，将组织脱水、包埋、切片后按he染色常规操作进行脱蜡、染色、脱水、封片。晾片24h后，显微镜观察胰腺组织的病理结构变化。

与正常组相比，模型组小鼠胰腺可见明显的慢性炎症及纤维化(p＜0.001)，表现为腺体萎缩、组织纤维化、管状复合结构增生和炎性细胞浸润；而oxatp组、tfpgl低、高剂量组细胞浸润、腺泡萎缩及纤维化程度评分较模型组均明显降低(均p＜0.05)。见图2，表2。

表2各组胰腺组织炎症损伤组织学评分(n＝10)

注：与对照组比较，1)p<0.001；与模型组比较，2)p<0.05。

2.胰腺胶原含量检查及定量分析：

石蜡切片采用苦味酸天狼星红染色评估胰腺组织胶原含量。切片脱蜡处理后，0.1％(w/v)天狼星红-饱和苦味酸溶液在室温下滴染1h，流水冲洗后苏木精复染10min。1％盐酸分化30s，自来水碱化后脱水透明，中性树脂封片。对胰腺组织胶原类型及其表达程度用偏振光显微镜进行分析，用image-proplus6图像分析软件量化colⅰ和colⅲ的含量(以视野中黄红色及绿色胶原面积表示)和胶原容积分数(collagenvolumefractions，cvfs)，cvfs＝(绿色胶原面积+黄红色胶原面积)/总面积(指照片视野面积)×100％。

苦味酸天狼星红染色在偏光显微镜下能特异地显示胶原组织。在偏光镜下，胶原ⅰ(colⅰ)呈黄或红色，胶原ⅲ(colⅲ)呈蓝绿或灰蓝色。在光镜下，可见模型组、oxatp组、tfpgl低剂量组、tfpgl高剂量组胶原特异性着色为红色，腺泡及胰岛萎缩，代之以胶原纤维。在偏光镜下可见，与正常组相比，雨蛙素注射后形成的慢性胰腺炎纤维化以colⅰ为主，且胶原含量明显增加(p＜0.001)；与模型组相比，tfpgl低、高剂量组colⅰ、colⅲ型胶原蛋白减少(p＜0.05)，其中tfpgl高剂量组colⅰ明显减少(p＜0.01)。见表3、图3。

表2各组胰腺组织胶原含量及cvfs的变化(n＝10)

注：与对照组比较，1)p<0.001；与模型组比较，2)p<0.05，3)p<0.01。

3.石蜡切片caspase-1，nlrp3，α-sma免疫组化染色

将胰腺组织石蜡切片60℃烘片30分钟后室温复温30分钟。将石蜡切片置于新鲜二甲苯脱蜡及乙醇梯度脱水后，3％h2o2室温孵育10min。tbst漂洗5min×3次后，将切片置于edta溶液微波热修复10min。羊血清封闭1小时，caspase-1、nlrp3或α-sma(均用羊血清工作液稀释至1:200)孵育4℃过夜。tbst漂洗5min×3次，生物素标记羊抗兔igg常温孵育1h，dab显色10min，tbst多次洗涤，苏木素复染，脱水，透明，中性树胶封片，镜下观察基因表达。

与正常组相比，模型组胰腺组织中α-sma、nlrp3、caspase-1表达显著升高(p＜0.01)；而oxatp、tfpgl作用于小鼠后，胰腺组织中α-sma、nlrp3和caspase-1表达均较模型组降低(p＜0.05)，其中tfpgl高剂量组胰腺组织中α-sma、nlrp3和caspase-1表达较模型组明显降低(p＜0.01)。见表4、图4。

表4各组α-sma、nlrp3和caspase-1光密度值定量分析(n＝10)

注：与对照组比较，1)p<0.01；与模型组比较，2)p<0.05，3)p＜0.01

4.酶联免疫吸附检测il-1β及il-18水平

新鲜胰腺组织用预冷pbs洗去血迹后，称取50mg，移入2ml离心管，加入500μl预冷ptr缓冲液。利用超声波细胞破碎仪匀浆10s，该过程在冰上进行。将组织匀浆液在冰上孵育20分钟后，4℃离心18000g20min，吸取上清液至新2ml离心管中。用bca法检测蛋白浓度。测得样品蛋白浓度为13μg·μl-1～16μg·μl-1，使用ptr缓冲液配平蛋白至相同浓度10μg·μl-1。应用酶联免疫吸附实验试剂盒说明书方法测定il-1β及il-18水平，结果见表5.

与正常组相比，模型组小鼠胰腺组织中il-1β及il-18蛋白浓度均显著升高(p＜0.01)。与模型组相比，oxatp、tfpgl治疗后，小鼠胰腺组织中il-β及il-18蛋白浓度呈现下降趋势(p＜0.05)。

表5胰腺组织中il-1β及il-18蛋白浓度的测定

注：与对照组比较，1)p<0.01；与模型组比较，2)p<0.05

5.统计学数据分析

实验所示数据至少有三次重复实验，组织切片每组10只动物均需制作一张切片。使用spss22.0进行数据统计分析。数据±代表标准差的值。计量资料均数间比较采用单因素方差分析，组间数据比较采用lsd-t法，两组组间比较采用配对样本t检验。p＜0.05为差异有统计学意义。

经过持续六周雨蛙素注射后，he染色、天狼星红染色及α-sma免疫组化染色结果均显示小鼠胰腺组织表现出明显的胰腺纤维化及腺泡萎缩、炎性细胞浸润等炎症表现。模型组colⅰ、colⅲ型胶原蛋白明显增多，且以colⅰ型胶原蛋白为主。nlrp3和caspase-1的蛋白表达水平明显升高，且与小鼠纤维化程度与nlrp3炎症体信号通路中的nlrp3、caspase-1蛋白表达趋势一致。模型组α-sma免疫组化显示，染色部位多位于腺泡细胞周围及近导管、血管区域，这与胰腺星状细胞(pancreaticstellatecells，pscs)在胰腺组织中的分布相符。p2x7r拮抗剂及番石榴叶总黄酮治疗后，与模型组相比，he染色、苦味酸天狼星红染色及α-sma免疫组化染色均显示小鼠胰腺纤维化程度受到了一定的抑制，且nlrp3、caspase-1、il-1β、il-18蛋白表达减少，提示番石榴叶总黄酮可能通过抑制nlrp3炎性体的活性，间接减少il-1β、il-18、il-33等促炎因子的修饰与活化，从而减少pscs激活。nlrp3炎症体也可促进tgfβⅰ及tgfβⅲ的表达，与tgfβ-smad信号通路之间互有影响，预示番石榴叶总黄酮可能抑制nlrp3炎症体激活间接抑制了tgfβ1表达，从而减少细胞外基质的生成。

综上所述，慢性胰腺炎过程中p2x7-nlrp3信号通路激活，促炎因子il-1β、il-18活化成熟并激活pscs，这与胰腺纤维化的进展密切相关。番石榴叶总黄酮可抑制nlrp3炎症体的激活，并显著改善雨蛙素诱导的慢性胰腺炎纤维化。