一种番石榴叶三萜类化合物的提纯方法与流程
本发明属于化合物提取领域，尤其涉及一种番石榴叶三萜类化合物的提纯方法。
背景技术：
番石榴(psidiumguajavalinn.)桃金娘科乔木，原产南美洲。中国华南各地栽培，常见有逸为野生种，北达四川西南部的安宁河谷，生于荒地或低丘陵上；果供食用；叶含挥发油及鞣质等，供药用，有止痢、止血、健胃等功效；叶经煮沸去掉鞣质，晒干作茶叶用，味甘，有清热作用。对番石榴叶的化学成分研究表明：番石榴叶中含有蛋白质、多糖、多酚、黄酮类化合物和三萜类化合物等。三萜类化合物(triterpenoids)是指在生源关系上由鲨烯衍生而来的萜类物质，通常由6个异戊二稀结构单元联结而成，构成含有30个碳原子的化合物，广泛存在于菌类﹑蕨类﹑单子叶﹑双子叶植物以及动物和海洋生物中。据研究，三萜类化合物具有抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、降低胆固醇、杀软体动物等活性，因而具有很强的研究和开发价值。
为数不多的现有技术中，三萜类化合物的提取一般多采用传统的溶剂萃取法，传统方法提取时间较长、工艺繁琐而且纯度较低，难以满足现代化发展的需求。且目前，尚未见番石榴叶三萜类化合物的提取纯化方法。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种番石榴叶三萜类化合物的提纯方法。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为提供一种番石榴叶三萜类化合物的提纯方法，包括如下步骤：
(1)将新鲜的番石榴叶清洁、烘干、粉碎成粉末后，过筛备用；
(2)以体积浓度为75％的乙醇作为浸提液，用超声波提取法对所述步骤(1)后得到的番石榴叶粉末进行浸提，收集提取液，该提取液为三萜类粗提液；
(3)将所述步骤(2)后得到的三萜类粗提液进行抽滤并收集滤液，然后浓缩滤液并收集浓缩液，过滤得到三萜类富集物；
(4)将所述步骤(3)后得到的三萜类富集物采用ab-8大孔吸附树脂吸附三萜类物质，洗脱后即获得纯化的番石榴叶三萜类化合物。
采用的超声波提取法需要的溶剂较少，提取的时间短、产品的含量高和操作简单方便，超声波提取番石榴叶中三萜类化合物具有可行性。本发明以体积浓度为75％的乙醇作为浸提液，相较于甲醇毒性大易残留，乙醇无毒易分离，且75％的体积浓度的浸提效果更好。
不同类型的树脂对不同天然产物(如多酚、黄酮、萜类等)的吸附特性不一样，ab-8型大孔吸附树脂是苯乙烯型弱极性共聚体，比表面积高于dm-301，最适宜水溶性、具有弱极性物质的提取、分离、纯化，因此本发明的番石榴叶中三萜类化合物纯化适合采用ab-8树脂。
上述的提纯方法，优选的，所述步骤(1)中，过筛为过40-60目筛。
优选的，所述步骤(2)中，超声波提取法采用的超声频率为800-1000w，番石榴叶与乙醇的料液比为1:10-15g/ml，提取温度为25-30℃。
优选的，所述步骤(2)中，浸提的次数为2-4次，总提取时间为30-35min，其中每次超声提取的时间不低于2s，间歇时间不低于0.5s。
优选的，所述步骤(3)中，抽滤为真空抽滤，所述浓缩滤液采用旋转蒸发仪进行浓缩。
优选的，所述步骤(3)中，过滤用有机微孔滤膜进行过滤，所述有机微孔滤膜的微孔直径不大于0.45μm。
有机微孔滤膜为高分子聚合物在特殊工艺条件下制成的一种耐各种有机溶剂的筛网型精密滤材，产品化学性能稳定，适应范围广，在有机溶剂长时间浸泡下，不易发生膨胀、溶解、变形、破坏或变质。
优选的，所述步骤(4)中，采用大孔吸附树脂吸附三萜类物质的具体操作包括如下步骤：对大孔吸附树脂进行预处理，树脂上柱，样液上柱，大孔吸附树脂解吸，洗脱以及洗脱液后续处理。
大孔吸附树脂是一种常用的分离纯化天然活性物质的方法，原理是：先用大孔树脂吸附三萜类化合物，再用乙醇溶液把吸附好的三萜类化合物洗脱下来进行收集。其具体操作步骤为：1)装柱：大孔吸附树脂先用95％的乙醇浸泡24h，采用湿法装柱，再用95％的乙醇冲洗树脂至流出液与水1：2混合不产生白色混浊，最后改用大量水洗，至无乙醇味为止；2)湿法上样：样液浓度为0.8mg/ml的三萜类富集物，ph＝6.0，上柱流速为2bv/h；一般来说：大孔树脂与进料液的体积比为(8-10):1，从而保障绝大部分的三萜类富集物会吸附到大孔树脂上；3)洗脱：所述清洗为用体积浓度为65％的乙醇以2bv/h进行清洗，纯的三萜类化合物就会逐步洗脱下来，进行收集后进行后续的高效液相色谱分析。
更优选的，所述样液上柱中，样液为浓度为0.8mg/ml的三萜类富集物，ph＝6.0，上柱流速为2bv/h；所述洗脱用体积浓度为65％的乙醇以2bv/h的流速进行洗脱。
优选的，所述步骤(4)中，采用高效液相色谱法测定洗脱后得到的洗脱液中三萜类化合物的含量，含量达到要求后即获得纯化的番石榴叶三萜类化合物。
通过高效液相色谱检测和分析，可准确分析最后得到的三萜类化合物的纯度，根据纯度可考虑是否进一步提纯，有效提高纯度。
更优选的，采用高效液相色谱法测定是采用hypersilc18柱进行检测，流动相为乙腈-水，检测波长205nm；所述hypersilc18柱的规格为4.6×200mm，5μm，柱温为30℃；所述乙腈的质量百分比从5％增至100％，乙腈的流速为0.6ml/min。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明的提纯方法，建立了超声波提取法、大孔吸附树脂纯化和高效液相色谱法(hplc)一体的分离纯化方法，具有耗能少，提取速度快、产率和纯度高的优点，相比常规的溶剂萃取法的产率提高了60％以上，纯度由原来的60-65％提高到了90％以上。
2、本发明的提纯方法，采用的超声波提取法需要的溶剂较少、提取的时间短、产品的含量高和操作简单方便，超声波提取番石榴叶中三萜类化合物具有可行性。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1：
一种本发明的番石榴叶三萜类化合物的提纯方法，包括如下步骤：
(1)将新鲜番石榴叶清洁、烘干、粉碎成粉末后，过40筛备用；
(2)以体积浓度为75％的乙醇作为浸提液，用超声波提取法对所述步骤(1)后得到的番石榴叶粉末进行浸提，收集提取液，该提取液为三萜类粗提液；浸提的次数为2次，总提取时间为32min，超声频率为850w，番石榴叶与乙醇的料液比为1:15g/ml，提取温度为30℃，收集提取液，该提取液为三萜类粗提液；
(3)将所述步骤(2)后得到的三萜类粗提液进行真空抽滤并收集滤液，然后采用旋转蒸发仪进行浓缩并收集浓缩液，用0.45μm的有机微孔滤膜过滤得到三萜类富集物；
(4)将所述步骤(3)后得到的三萜类富集物采用大孔吸附树脂进行吸附以实现三萜类物质的纯化，包括大孔吸附树脂预处理，树脂上柱，样液上柱，大孔吸附树脂的解吸，大孔吸附树脂的清洗、再生以及洗脱液后续处理(树脂采用ab-8树脂，上柱的样液为浓度为0.8mg/ml的三萜类富集物，ph＝6.0，上柱流速为2bv/h，用体积浓度为65％的乙醇以2bv/h进行清洗)，然后采用高效液相色谱法测定番石榴叶中三萜类化合物的含量(采用hypersilc18柱进行检测，4.6×200mm，5μm；流动相为乙腈-水，乙腈的质量百分比从5％增至100％，乙腈的流速为0.6ml/min，检测波长205nm)，含量达到要求后即获得纯化的番石榴叶三萜类化合物。
该方法提纯的番石榴叶三萜类化合物，经检测，产率为三萜类富集物中的72.8％左右，纯度为90.1％左右。
实施例2：
一种本发明的番石榴叶三萜类化合物的提纯方法，包括如下步骤：
(1)将新鲜番石榴叶清洁、烘干、粉碎成粉末后，过60筛备用；
(2)以体积浓度为75％的乙醇作为浸提液，用超声波提取法对所述步骤(1)后得到的番石榴叶粉末进行浸提，收集提取液，该提取液为三萜类粗提液；浸提的次数为4次，总提取时间为35min，超声频率为800w，番石榴叶与乙醇的料液比为1:15g/ml，提取温度为28℃，收集提取液，该提取液为三萜类粗提液；
(3)将所述步骤(2)后得到的三萜类粗提液进行真空抽滤并收集滤液，然后采用旋转蒸发仪进行浓缩并收集浓缩液，用0.45μm的有机微孔滤膜过滤得到三萜类富集物；
(4)将所述步骤(3)后得到的三萜类富集物采用大孔吸附树脂进行吸附以实现三萜类物质的纯化，包括大孔吸附树脂预处理，树脂上柱，样液上柱，大孔吸附树脂的解吸，大孔吸附树脂的清洗、再生以及洗脱液后续处理(树脂采用ab-8树脂，上柱的样液为浓度为0.8mg/ml的三萜类富集物，ph＝6.0，上柱流速为2bv/h，用体积浓度为65％的乙醇以2bv/h进行清洗)，然后采用高效液相色谱法测定番石榴叶中三萜类化合物的含量(采用hypersilc18柱进行检测，4.6×200mm，5μm；流动相为乙腈-水，乙腈的质量百分比从5％增至100％，乙腈的流速为0.6ml/min，检测波长205nm)，含量达到要求后即获得纯化的番石榴叶三萜类化合物。
该方法提纯的番石榴叶三萜类化合物，经检测，产率为三萜类富集物中的73.6％左右，纯度为93.7％左右。
对比例1：
一种番石榴叶三萜类化合物的提纯方法，包括如下步骤：
(1)将新鲜番石榴叶清洁、烘干、粉碎成粉末后，过40筛备用；
(2)取所述步骤(1)后得到的番石榴叶粉末，加入8倍量50％的甲醇，回流提取三次，每次为1.5h，过滤，合并滤液，回收溶剂至浸膏状；
(3)将所述步骤(2)制得的浸膏用水分散，用氯仿萃取3次，合并氯仿层，减压浓缩到原体积的1/3，用饱和碳酸氢钠溶液碱化，取氯仿层部分浓缩，得到棕色浸膏并用硅胶柱层析分离，得到提纯的三萜类化合物。
该方法提纯的番石榴叶三萜类化合物，经检测，产率为三萜类富集物中的45％左右，纯度为65％左右。
对比例2：
一种番石榴叶三萜类化合物的提纯方法，包括如下步骤：
(1)将新鲜番石榴叶清洁、烘干、粉碎成粉末后，过40筛备用；
(2)取所述步骤(1)后得到的番石榴叶粉末，加入8倍量50％的甲醇，回流提取三次，每次为1.5h，过滤，合并滤液，回收溶剂至浸膏状；
(3)将所述步骤(2)制得的浸膏用水分散，用水饱和的乙酸乙酯萃取，合并萃取液，回收溶剂得浸膏，干燥；
(4)将所述步骤(3)后得到的三萜类富集物用50％乙醇溶解，采用大孔吸附树脂进行吸附以实现三萜类物质的纯化，包括大孔吸附树脂预处理，树脂上柱，样液上柱，大孔吸附树脂的解吸，大孔吸附树脂的清洗、再生以及洗脱液后续处理(树脂采用ab-8树脂，上柱的样液为浓度为0.8mg/ml的三萜类富集物，ph＝6.0，上柱流速为2bv/h，用体积浓度为65％的乙醇以2bv/h进行清洗)。
该方法提纯的番石榴叶三萜类化合物，经检测，产率为三萜类富集物中的60％左右，纯度为73％左右。
本发明的提纯方法，建立了超声波提取法、大孔吸附树脂纯化和高效液相色谱法(hplc)一体的分离纯化方法，具有耗能少，提取速度快、产率和纯度高的优点，相比常规的溶剂萃取法的产率提高了60％以上，纯度由原来的60-65％提高到了90％以上。
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