黑木耳中抑制胰脂肪酶活性物质的提取工艺及体外抑制效果

• 泰然健康网
• 2024-12-18 18:34

Extraction technology and inhibitory effects in vitro of substances inhibiting pancreatic lipase activities from fruiting body of Auricaria heimuer

HUANG Lin-Xiang1, SHI Le-Le2, CAI Zhi-Ying3, JI Peng-Wei4, WANG Chen-Li1, CHEN Bing-Zhi ,1,*, JIANG Yu-Ji ,1,*, XIE Bao-Gui5

1 College of Food Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China

2 Fujian Edible Fungi Technical Popularized Station, Fuzhou, Fujian 350003, China

3 Agriculture Bureau of Longhai City, Longhai, Fujian 363101, China

4 Xinfa Biotechnology Co. Ltd., Zhangzhou, Fujian 363107, China

5 Mycological Research Center, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China

肥胖正成为本世纪全球最大的健康威胁之一,目前肥胖的高患病率是大众健康的主要威胁（Rishi et al. 2017）。肥胖引发的并发症包括：高血压、心脑血管疾病和Ⅱ型糖尿病等（Kopelman 2000）。研究发现,食物中的脂肪在肠道内被胰脂肪酶水解成为甘油、脂肪酸后才能被小肠吸收,而后在体内重新组合成为脂肪,胰脂肪酶在此过程中起着重要的作用（Birari & Bhutani 2007）。如能有效控制胰脂肪酶的活性,可以减少食物中脂肪的吸收。近年来,半合成的胰脂肪酶的抑制剂Orlistat已经应用到临床,但患者服用后容易产生头痛、腹泻等副作用（Garza et al. 2011）,因此,研究一种天然的胰脂肪酶抑制剂在控制肥胖方面具有重要意义。

3T3-L1小鼠前脂肪细胞是目前进行脂肪代谢研究中广泛使用的一种细胞,其诱导分化成为成熟脂肪细胞的过程中,伴随着细胞形态的变化、脂质的积累等,能够充分体现体脂肪细胞的特色（Haugen et al. 2005）。本研究以黑木耳提取物作用于3T3-L1脂肪细胞,观察提取物对细胞活性和分化方面的影响,以期为黑木耳提取物在减肥降脂方面的应用及相关产品的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

1.1.1 材料：黑木耳子实体由北大荒营销股份有限公司提供,新鲜黑木耳经公司清洗晒干,未经化学处理。猪胰脂肪酶：上海源叶生物科技有限公司。阿拉伯树胶、异丙醇、二甲基亚砜（Dimethyl sulfoxide,DMSO）（分析纯）、4-硝基苯棕榈酸酯（p-nitrophenyl butyrate,PNPP）、4-硝基苯酚（p-nitrophenyl,PNP）、三羟甲基氨基甲烷脱氧胆酸盐：上海麦克林生化科技有限公司。细胞株,3T3-L1前脂肪细胞,购自中国科学院昆明细胞库。DMEM高糖培养基：Hyclone公司。胰岛素、IBMX、地塞米松、胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液（PBS 1x）,MTT、青霉素链霉素双抗溶液（100x）：北京Solarbio科技有限公司。胎牛血清：Gibco南美（10270-106）。

1.1.2 仪器与设备：酶标仪,上海巴玖SAF680T;真空冷冻干燥机,松源LGJ-12;-80℃冰箱,美菱超低温冷冻储存箱DW-HL528;旋转蒸发仪,上海亚荣生化仪器厂RE52-99;离心机,Thermo Scientific ST40;CO2恒温细胞培养箱,上海一恒科学仪器有限公司BPN-50CH;倒置显微镜,NIKON TS100-F;超净工作台,上海博迅实业有限公司BJ-1CD。

1.1.3 溶液的配制：（1）Tris-HCl缓冲液：6.05g Tris置于1L烧杯中,去离子水溶解,加入0.1%阿拉伯树胶粉（1g）、0.2%脱氧胆酸钠（2g）,配置成50mmol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液。（2）胰脂肪酶溶液：Tris-HCl缓冲液溶解0.25g胰脂肪酶,混匀静置,5 000r/min离心5min,取上清液,配成1.2mg/mL胰脂肪酶溶液（PPL）,-20℃保存。（3）底物溶液：4-硝基苯棕榈酸酯（PNPP）20mg溶于5mL异丙醇,再用Tris-HCl缓冲液定容到100mL。（4）DMEM完全培养液：10%胎牛血清+1%双抗+89% DMEM高糖培养基,4℃保存。（5）诱导分化液Ⅰ：含有10μg/mL胰岛素、1μmol/L地塞米松（Dexamethasone,DEX）、0.5mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（3-isobutyl-1-methyl-7H- xanthine,IBMX）的DMEM完全培养液。（6）诱导分化液Ⅱ：10μg/mL胰岛素的DMEM完全培养液。

1.2 实验方法

1.2.1 黑木耳提取物的制备：（1）黑木耳水提物（Auricularia heimuer water extract,AHW）的制备：将黑木耳粉碎过60目筛,称取14g黑木耳粉,加入一定量的水,在热水浴中浸提,过滤收集滤液,将滤液4 000r/min离心10min,取上清液,残渣再用热水浸提1次,合并两次所得上清液。加入3倍体积的无水乙醇4℃冰箱静置过夜,然后4 000r/min离心10min,弃上清得沉淀,旋转蒸发到一定的体积,最后进行冷冻干燥得黑木耳水提物。（2）黑木耳醇提物（Auricularia heimuer alcohol extract,AHA）的制备：将黑木耳进行粉碎过60目筛,称取14g黑木耳粉,加入一定量的乙醇,超声处理30min后,再进行水浴浸提,抽滤得滤液,滤渣加入乙醇重复上述操作,合并2次滤液并进行旋转蒸发,待乙醇全部挥发掉,再用适量的水溶解后进行冷冻干燥,最后得黑木耳醇提物。

1.2.2 PNP标准曲线的绘制：精确称取4-硝基苯酚（PNP）标准品7.0mg,溶于二硝基亚砜（DMSO）,定容到10mL,制成浓度为5mmol/L母液。用Tris缓冲液稀释母液,将PNP溶液稀释至0.05mmol/L、0.25mmol/L、0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L,测定不同浓度的PNP在405nm下的吸光值。以不同PNP的浓度为横坐标,以吸光值为纵坐标,得标准曲线。

1.2.3 胰脂肪酶反应体系的建立：准确称取黑木耳提取物0.1g,用10mL的Tris-HCl缓冲液配置成浓度为10mg/mL的提取物溶液（醇提物用0.5mL的DMSO进行助溶）。测定方法参照Liang et al.（2014）的条件,并做调整。实验分为空白组、对照组、样品空白组和样品组,各反应物剂量见表1,在96孔板中进行加样,每组5个平行。实验条件模拟人体环境（尚渤程和黎一苇 2009）进行设计,依次加入pH 8.0的Tris-HCl缓冲液、抑制剂溶液和酶溶液,混合均匀,于37℃水浴保温10min,结束后,取出96孔板,加入底物溶液,充分混匀,于37℃水浴反应20min。由于PNPP在胰脂肪酶的作用下能水解产生PNP,PNP在405nm处有最大吸光值,测定其吸光值,计算各样品对胰脂肪酶的抑制率及IC50值,计算公式如下：

抑制率(%)=$lgroup 1-frac{B_{1}-B_{0}}{A_{1}-A_{0}} rgroup$×100

式中：A1为空白组,A0为对照组,B1为样品空白组,B0为样品组。

表1  反应体系各溶液加入量

Table 1  Addition quantity of solutions in reaction system

实验组
Test groupTris-HCl
(µL)PPL
(µL)PNPP
(µL)Inhibitor
(µL)A150501000A010001000B1305010020B080010020

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1.2.4 提取工艺优化：为了比较AHA和AHW两种提取物对胰脂肪酶的抑制效果,以抑制率为指标对提取工艺进行单因素和正交试验。根据张焕丽等（2016）的研究,AHA单因素试验时,设计的浸提温度为60℃、70℃、80℃、90℃;浸提时间为0.5h、1h、2h、4h;乙醇浓度为60%、70%、80%、90%;料液比为1:10、1:20、1:30、1:40。根据单因素试验结果,进行4因素3水平正交优化实验。

根据陆雯等（2010）的研究,AHW单因素实验时,浸提温度为60℃、70℃、80℃、90℃;浸提时间为0.5h、1h、1.5h、2h;料液比为1:25、1:30、1:35、1:40,根据单因素试验结果,进行了3因素3水平正交优化实验。

1.2.5 不同浓度的黑木耳提取物对胰脂肪酶抑制作用的影响：按照1.2.3确定的反应体系进行实验,以黑木耳醇提物和水提物质量浓度（800μg/mL、400μg/mL、200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL）为横坐标,胰脂肪酶的抑制率为纵坐标,建立回归曲线,比较两种提取物不同浓度对胰脂肪酶抑制率大小的影响并计算半抑制浓度IC50。

1.2.6 抑制类型的确定：根据上述1.2.5实验的结果,选取抑制率最高的黑木耳醇提物进行抑制类型的分析。在PNPP底物的浓度为0.1mmol/L和0.3mmol/L的条件下,分别测定0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL黑木耳醇提物的酶促反应速度,以提取物的浓度为横坐标,以反应速度的倒数为纵坐标,按Dixon法作图,求得抑制常数Ki。

在黑木耳醇提物溶液浓度为0mg/mL、2mg/mL、8mg/mL时,测定底物浓度分别为0.38mg/mL、0.76mg/mL、1.13mg/mL、1.89mg/mL的反应速度。对照组以Tris-HCl缓冲液代替提取物溶液,以反应速度的倒数为纵坐标,底物浓度的倒数为横坐标,作Lineweaver-Burk图,确定黑木耳醇提物对胰脂肪酶的抑制类型。

1.2.7 黑木耳醇提物对3T3-L1前脂肪细胞活性的影响：将3T3-L1前脂肪细胞以1×104个/孔接种至96孔板中,每孔加180µL DMEM完全培养液培养24h,弃培养液加入新鲜的培养液180µL,同时加入20µL黑木耳醇提物溶液使最终浓度分别为100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL、1 000μg/mL,继续培养24h、48h、72h,以不加提取物的培养组为对照,每个处理设置5个重复孔。培养结束后吸弃培养液,加入新鲜完全培养液180µL,避光加入MTT溶液20µL,培养箱内培养4h后吸弃培养液和MTT,加入180µL DMSO振荡10min,充分溶解后在570nm下测定吸光值。细胞活性计算公式：细胞活性(%)=药物处理组OD值/对照组OD值×100。

1.2.8 黑木耳醇提物抑制3T3-L1前脂肪细胞分化的测定：根据细胞活性实验的结果,选择对细胞活性无影响的提取物浓度进行细胞分化抑制实验。诱导方法采用经典的“鸡尾酒”诱导法（Vishwanath et al. 2013）。将3T3-L1前脂肪细胞以3×104个/孔接种至24孔板中,用DMEM完全培养液培养细胞,待细胞贴壁长满至80%-90%以后,接触抑制2d,即细胞退出生长周期,加入诱导分化液Ⅰ,再加入提取物使其浓度为50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL、1 000μg/mL,同时以不加黑木耳醇提物,加入相应体积DMEM完全培养液作为对照组,诱导过程中使各孔的提取物浓度保持不变。每个处理设置4个重复孔,刚加入诱导液Ⅰ时为诱导分化D0,培养2d后换诱导分化液Ⅱ（D2）,2d后换DMEM完全培养液继续培养（D4）,以后每2d换一次培养液,分化至D10结束。用油红O染色试剂盒进行染色,对染色后的细胞拍照。随后每孔加入1mL的异丙醇进行甘油三酯的萃取,30min后在510nm下测定萃取液的吸光值,得分化脂质积累量。

1.3 统计方法

应用SPSS 16.0软件进行统计分析,各组测定值以平均值±标准差表示,组间差异按方差分析进行检验,并用最小显著差法检验作两两比较,以P<0.05为显著差异,以P<0.01为极显著差异。做图软件使用origin8.0。

2 结果与分析

2.1 PNP的标准曲线

将PNP稀释成不同浓度,利用酶标仪在405nm处测定吸光值,以葡萄糖浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,绘制标准曲线（图1）,建立回归方程为y=8.3623x-0.0087,R2=0.9998,说明两者在0.05-0.3mmol/L之间有良好的线性关系。

图1

图1  PNP与吸光值的关系

Fig. 1  The relationship between PNP and absorbance.

2.2 黑木耳醇提单因素试验

AHA提取工艺单因素实验结果表明,随着乙醇浓度的增大,对胰脂肪酶的抑制率呈现逐步上升的趋势,乙醇浓度为70%、80%、90%时的抑制率均显著高于乙醇浓度为60%时的抑制率,乙醇浓度80%与90%的抑制率较高,但两者之间无明显差异;随着提取温度的升高,AHA对胰脂肪酶的抑制率呈现上升的趋势,提取温度80℃、90℃提取物的抑制率显著高于60℃提取物的抑制率,但两者间的抑制率无显著差异;随着料液比的增加,提取物对胰脂肪酶的抑制率逐渐减少,料液比1:10时抑制率最高,各组的抑制率没有显著性差异;提取时间2h和4h的抑制率显著高于0.5h和1h的抑制率,2h与4h之间的抑制率无显著性差异,因此,最适提取条件为乙醇浓度80%,温度80℃,料液比1:10,时间2h（图2）。

图2

图2  AHA提取工艺的单因素实验

其中*P<0.05;**P<0.01

Fig. 2  Single factor experiment of extraction process of Auricularia heimuer alcohol extract (AHA).

*P<0.05; **P<0.01. The same below.

2.3 黑木耳醇提正交实验

综合AHA单因素实验结果,选取正交实验的条件为乙醇浓度：70%、80%、90%;提取温度：70℃、80℃、90℃;料液比：1:30、1:20、1:10;提取时间：1h、2h、4h;对提取工艺进行4因素3水平的正交试验优化。由极差分析可知影响胰脂肪酶抑制率的因素顺序是A>C>D>B,即提取温度>提取时间>料液比>乙醇浓度,并通过方差分析可得AHA对胰脂肪酶抑制率的最优组合为：提取温度70℃、提取时间1h、乙醇浓度90%、料液比1:20。通过验证试验得到该组合的抑制率达到63.21%,与其他的因素组合相比达到最高抑制率,证明此条件下为AHA抑制胰脂肪酶的最优组合（表2）。

表2  AHA提取工艺正交试验

Table 2  Orthogonal experiments of AHA extraction process

试验号
Test number因素Factor抑制率
Inhibition rate of pancreatic
lipase activity of the extract (%)A-提取温度
Extraction
temperature (°C)B-乙醇浓度
Alcohol
concentration (V/V)C-提取时间
Extraction
duration (h)D-料液比
Solid material
-liquid ratio (g/mL)1707011:3049.46±0.232708021:2050.40±0.643709041:1040.74±1.314807021:1033.03±0.955808041:3031.05±0.976809011:2050.77±2.317907041:2033.80±1.678908011:1034.16±1.649909021:3043.32±0.89k1140.60116.29134.39123.83k2114.85115.61126.75134.97k3111.28134.83105.59107.93K146.8638.7644.7941.28K238.2838.5442.2544.99K337.0944.9435.2035.98R9.776.49.599.01主次顺序RA>RC>RD>RBPrimary and secondary sequence最优组合A1B3C1D2Optimal combination

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2.4 黑木耳水提单因素实验

AHW提取工艺单因素试验结果表明,料液比低于1:30时,随着料液比的增加,抑制率有上升趋势,料液比1:30与1:25的抑制率无显著性差异,且与料液比1:40、1:35相比呈显著性差异;随着温度的升高,AHW对胰脂肪酶的抑制率有上升趋势,温度80℃、90℃的抑制率较高,与60℃相比呈显著性差异;时间分析表明1、1.5、2h 3个时间的胰脂肪酶抑制率无显著性差异,与提取时间为0.5h的AHW相比三者抑制率较高且有显著性差异,因此,最适提取条件为料液比1:35、提取温度80℃、时间1h（图3）。

图3

图3  AHW提取工艺的单因素实验

Fig. 3  Single factor experiment of extraction process of Auricularia heimuer water extract (AHW). *P<0.05; **P<0.01.

2.5 黑木耳水提正交实验

综合AHW单因素实验的结果,选取正交实验的条件为提取温度：70℃、80℃、90℃;料液比：1:30、1:35、1:40;提取时间：1h、1.5h、2h;对提取工艺进行3因素3水平的正交试验优化。由极差分析可知影响胰脂肪酶抑制率的因素顺序是B>A>C,即提取温度>料液比>提取时间,并通过方差分析可得AHW对胰脂肪酶抑制率的最优组合为：提取温度70℃、提取时间2h、料液比1:40。通过验证试验得到该组合的抑制率达到54.28%,与其他的因素组合相比达到最高抑制率,证明此条件下为AHW抑制胰脂肪酶的最优组合（表3）。

表3  AHW提取工艺正交试验的优化

Table 3  Orthogonal experiments of AHW extraction process

试验号
Test number因素Factor抑制率
Inhibition rate of pancreatic lipase
activity of the extract (%)料液比
Solid material
-liquid ratio (g/mL)B-提取温度
Extraction
temperature (°C)C-提取时间
Extraction
duration (h)11:3070145.90±1.32221:30801.528.53±2.34131:3090229.67±0.13941:35701.537.67±0.94351:3580245.56±2.13661:3590133.01±1.34571:4070243.27±0.29781:4080133.81±3.00191:40901.539.59±1.064k1104.1126.84112.72k2116.24107.9105.79k3116.67102.27118.5K134.742.2837.57K238.7535.9735.26K338.8934.0939.5R4.198.193.93主次顺序RB>RA>RCPrimary and secondary sequence最优组合A3B1C3Optimal combination

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2.6 不同浓度黑木耳提取物对胰脂肪酶抑制作用的影响及比较

随着黑木耳提取物的浓度的增大,对胰脂肪酶的抑制率呈增加趋势,这说明提取物对胰脂肪酶有一定的抑制作用,当提取物浓度达到800μg/mL时,抑制率的增加趋势逐渐处于平缓。通过观察可得AHA的抑制率始终大于AHW,并通过计算,得出AHA的IC50=850.59μg/mL,AHW的IC50=681.56μg/mL,进一步验证AHA对胰脂肪酶的抑制率大于AHW对胰脂肪酶的抑制率（图4）。

图4

图4  黑木耳提取物质量浓度对抑制作用的影响

Fig. 4  Effects of AHFB extract concentration on inhibition rate of pancreatic lipase activity.

2.7 黑木耳醇提物对胰脂肪酶的抑制作用类型

由于AHA对胰脂肪酶的抑制作用强于AHW,故以AHA为抑制剂研究其抑制作用类型。两条直线相交于（-4.69,0）（图5）,故抑制常数Ki=4.69mg/mL。三条直线相交于一点（图6）,AHA的加入并未改变酶促反应Km,而Vmax则有所降低,结合Dixon图和Lineweaver-Burk图的特征可以看出AHA对胰脂肪酶的抑制类型为非竞争性抑制。黑木耳醇提物和底物可以同时与胰脂肪酶结合,两者没有竞争性。

图5

图5  AHA对胰脂肪酶抑制作用的Dixon图

Fig. 5  Dixon picture of inhibitory effect of AHA on pancreatic lipase activity.

图6

图6  AHA对胰脂肪酶抑制作用的Lineweaver-Burk图

Fig. 6  Lineweaver-Burk plot of inhibitory effect of AHA on pancreatic lipase activity.

2.8 黑木耳醇提物对3T3-L1前脂肪细胞活性的影响

不同浓度的AHA在24h、48h、72h下对3T3-L1细胞活性的影响,与对照组相比,10个浓度下的AHA在3个不同时间下对细胞的活性无显著性差异,证明AHA对细胞无毒性（图7）。

图7

图7  不同浓度的AHA对3T3-L1前脂肪细胞活性的影响

Fig. 7  Effects of different AHA concentrations on the viability of 3T3-L1 preadipocytes.

2.9 黑木耳醇提物对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响

细胞油红O染色结果见图8、图9。随着AHA的浓度增大,对细胞脂质积累抑制作用增大,即抑制前脂肪细胞分化为脂肪细胞。当AHA的浓度达到200μg/mL时,处理细胞脂质积累量与空白组相比显著性差异（P<0.05）,当AHA的浓度达到400μg/mL时,处理细胞脂质积累量与空白组相比呈极显著性差异（P<0.01）。且随着AHA的浓度增大对细胞的分化抑制作用呈现剂量依赖性。

图8

图8  3T3-L1前脂肪细胞各试验组油红O染色后照片（400×）

A：空白组;B：AHA浓度50μg/mL;C：AHA浓度200μg/mL;D：AHA浓度400μg/mL;E：AHA浓度600μg/mL;F：AHA浓度800μg/mL

Fig. 8  3T3-L1 preadipocytes of experimental groups stained by oil red O (400×).

A: Blank control group; B: 50μg/mL AHA; C: 200μg/mL AHA; D: 400μg/mL AHA; E: 600μg/mL AHA; F: 800μg/mL AHA.

图9

图9  不同浓度AHA处理对3T3-L1前脂肪细胞脂质积累量的影响

Fig. 9  Effects of different concentrations of AHA on lipid accumulation in 3T3-L1 preadipocytes.

3 讨论

肥胖是一种能量摄入和支出之间不平衡引起的慢性代谢紊乱,曾经被认为只存在于一些发达国家,但随着经济全球化的发展,这些问题现在普遍出现在低收入和中等收入国家,尤其是在大城市当中的发病率较高（Damsgaard et al. 2016）。

本研究对黑木耳水提物和醇提物的提取工艺进行了优化,并比较了黑木耳醇提物、水提物对胰脂肪酶的不同抑制效果,结果表明：黑木耳醇提物对胰脂肪酶活性的抑制性较强,对胰脂肪酶的抑制类型为非竞争性抑制。黑木耳醇提物对3T3-L1前脂肪细胞生长活性无明显的影响,并能够显著地降低细胞分化过程中的脂质积累量,抑制细胞分化为成熟脂肪细胞,说明醇提物在肥胖治疗方面有潜在的应用价值。

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网址: 黑木耳中抑制胰脂肪酶活性物质的提取工艺及体外抑制效果 https://m.trfsz.com/newsview626948.html