如何用显微成像解决方案“助力类器官研究”
一、引 言
每年年底，《Nature Methods》都会对过去一年中推动生命科学发展的技术方法做出回顾与总结，由此评选出当年最受瞩目、影响力最大的技术。
2017年，类器官（organoids）荣膺Nature Methods年度生命科学技术。在广大科研工作者的不懈努力之下，近年来，类器官研究取得了丰硕的研究成果。
所谓的“类器官”是由干细胞或肿瘤细胞在三维培养条件下自我组装而成的一种三维的微器官，它能够高度模拟原位组织的生理结构和功能，经长期传代保持稳定的遗传信息。
类器官可以称得上是神奇的“多面手”，其高度仿真的特性，让研究人员可以利用该模型，深入观察器官的发育进程，检验药物的功能以及发展实验室层面的再生治疗方法。
本文作者：Dr. Grace Yuan
二、类器官培养进展
2019年美国宾夕法尼亚大学的科研人员在Cell上发表了题为“A Patient-Derived Glioblastoma Organoid Model and Biobank Recapitulates Inter- and Intra-tumoral Heterogeneity”的文章，文章中报道了病人源性胶质母细胞瘤类器官（glioblastoma organoid，GBO）模型和生物库的建立。
该研究表明GBO保留了胶质母细胞瘤的主要特征，可以迅速用于为患者制定治疗策略。科研人员建立的生物库为胶质母细胞瘤基础和转化研究提供了丰富的资源。
通过明场图像展示保留亲代肿瘤组织学特征的病人源性胶质母细胞瘤类器官的形成过程
在这篇文章中，科研工作者不仅通过显微镜观察记录了类器官的生长过程和形态变化，还通过激光扫描共聚焦显微镜观察了一些蛋白标志物在类器官中的表达模式，证明了类器官细胞形态与特征上明显的异质性，其细胞组成与亲代肿瘤高度相似。
共聚焦图像展示了病人源性胶质母细胞瘤类器官中的微血管以及缺氧梯度。框1中细胞因缺氧无增殖细胞产生，而框2中绿色细胞为增殖细胞。
2020年1月24日，Science期刊发表了一篇题为“Chromatin accessibility dynamics in a model of human forebrain development”的论文。在这篇论文中，科研人员描述了人类前脑类器官的培育及用途。作为球状结构，人类前脑类器官可以自组装成前脑的不同部分。更令人兴奋的是，研究人员还找到了一种可以极大地延长人类前脑类器官的寿命（长达300天）的方法，这足以观察到前脑类器官发展成更复杂的结构。
2022年发表在Science上的“Amplification of human interneuron progenitors promotes brain tumors and neurological defects”，揭示了人类特定的发育过程是导致皮质发育畸形(MCDs)的原因，这会导致儿童发育迟缓和癫痫。研究中，科研人员建立了结节硬化症(tuberous sclerosis complex, TSC)的人脑类器官模型，并鉴定了一种特定的神经干细胞类型，即尾部晚期中间神经元祖细胞 (caudal late interneuron progenitor，CLIP)。在TSC中，CLIP细胞过度增殖，产生过多的中间神经元、脑肿瘤和皮层畸形。
虽然类器官作为研究模型，在发育、疾病和药物研究，以及再生医学等领域具有广阔的发展前景，但因其培养条件及结构等都要比贴壁细胞复杂，因此在类器官的培养、观察以及数据量化分析方面，都具有很多难点。今天就给大家简单梳理一下，显微成像设备如何助力类器官的培养、观察和数据分析。
三、显微成像助力类器官相关研究
1. 类器官的培养质控
类器官制备的典型方法是分离胚胎或多能干细胞，然后将这些细胞培养在基质胶Matrigel类的支持介质上，使其能够三维生长。介导类器官形成的信号通路与体内器官发育与稳态维持的信号通路是相同的，因此，细胞因子、生长因子和小分子也要添加到培养基中，以激活或者抑制参与类器官形成的特定信号通路。制备不同的类器官需使用不同的添加物组合，即使对于小肠和结肠等结构非常相近的组织，添加物的组合也不尽相同。
有研究表明，未分化状态培养过程中 iPS 细胞系的初始增殖状态对随后的分化诱导效率有着极大的影响。因此，在为类器官分化阶段开发更优方案之外，优化单个 iPS 细胞系的未分化状态培养阶段的方案，对于可重复地生成多份类器官样本来说至关重要。
奥林巴斯公司研发的CM20细胞培养监测系统可将监控头和细胞或类器官培养物共同置于培养箱中，系统定期对培养标本进行扫描，数据将通过计算机工作站进行无线通信。使用CM20 细胞培养监测系统，对样品进行时间序列培养数据采集、存储和分析，科研工作者能够了解 iPS 细胞在培养期间的状态，并确定提高分化效率的关键因素，从而进一步改进试验方案。
细胞培养监控系统CM20
由于类器官的培养时间长，所需培养基以及维持其生长的添加物价格较贵，因此科研工作者需要特别关注类器官的培养过程及其生长状况，并且尽量避免培养中的类器官被污染。使用CM20系统后，科研人员无需进入洁净室从培养箱中取出标本镜检，即可对培养标本的生长状况进行远程监控，极大地提升了实验效率，降低了污染的风险。
CM20系统除了帮助科研人员远程监控持续培养中的标本的生长状况，还可以提供定量数据，例如对细胞进行计数并确定融合度分析，从而帮助广大科研工作者优化培养条件，实现对培养物进行精确的质量控制并评估实验流程节点。
CM20拍摄到的类器官在培养箱中的发育过程
2. 类器官的显微成像
由于类器官属于三维细胞培养物，具有一定的体积，因此在进行成像时，为了获取完整的类器官形态特征及内部细胞结构，能够采集多层Z轴图像信息进行3D成像的显微成像设备是首选。
1）激光扫描共聚焦因其光路设计中增加了用于阻挡非焦平面信息的针孔，可以提高Z轴的分辨率，适合对类器官标本进行Z序列图像的采集。
奥林巴斯激光扫描共聚焦FV3000具有灵敏度高、成像精度高、光谱分辨率高等特点，系统采用专利的体相位全息透射衍射光栅进行分光，可在所有通道上进行高效、准确的全真光谱检测获得高分辨率、高对比度的样品图像，从而构建精确的3D图像，特别适合进行类器官的深层观察。该系统还提供了成熟的近红外成像解决方案，近红外成像由于具有穿透深、光毒性小、组织自发光干扰小等优点，可与可见光范围内的各种荧光染料搭配，进行无串扰的类器官多色荧光成像。
激光扫描共聚焦显微镜FV3000
FV3000对3D培养的细胞球连续观察21天。SYTOX® Orange标记细胞核，Alexa Fluor 488 标记了细胞骨架。
2）对于体积较大的类器官标本，不仅需要采集Z序列图像，往往还需要进行拼图，这对成像系统的图像采集速度有较高的要求。
奥林巴斯超分辨转盘共聚焦SpinSR具有成像速度快、灵敏度高、光毒性低、可升级分辨率高达110nm的超分辨模块等特点，可以对类器官标本进行快速的Z序列成像及拼图。SpinSR系统可搭配奥林巴斯率先研发的一系列硅油物镜，对类器官进行高分辨率高信噪比深层成像。
超分辨转盘共聚焦系统SpinSR
适合进行深层成像的硅油物镜
硅油物镜以其特殊的折射率为1.40的硅油做为介质，即满足采集高分辨率图像的要求（分辨率高于浸水介质物镜），又满足类器官等厚标本的高散射标本观察。
3）对于体积较大的类器官标本，为了采集到完整的标本图像，对成像深度有更高的需求。双光子或者光片显微镜是最适合进行深层成像的显微成像系统。
奥林巴斯FVMPE-RS多光子显微镜采用了先进的光学设计，可提高深度成像灵敏度和分辨率。400 nm至1600 nm的超宽光谱透过率可在不影响短波长检测的情况下实现更高效近红外激发；大靶面高效率的检测光路可以汇集更多的发射信号，尤其是大角度的散射光子 ，采集到类器官标本更深层的信息；TruResolution物镜可通过自动球差补偿提高深层成像亮度和分辨率，从而获得三维图像在各个层面上的更多细节信息。
双光子显微镜 FVMPE-RS
奥林巴斯在售的光片显微镜系统 Alpha3 具备实时光学聚焦扩展功能的双照明系统，可在整个视场上实现均匀照明，有助于获取标本的全部信息，并使得采集到的类器官Z序列数据，经3D重构后完全没有拼接的痕迹；
系统可以搭配多种耐腐蚀样品适配器，具备从细胞到整个透明化组织或生物体成像的灵活性；该光片系统还具备智能3D扫描技术，能够以75幅/秒的速度采集图像；兼容奥林巴斯全系列物镜，适合对多种标本进行从宏观到微观的成像。
需要特别注意的是，当类器官体积较大时，则需要对其进行透明化处理，才能利用光片显微镜或双光子显微镜采集到完整的类器官图像。
光片显微镜系统Alpha3
3. 类器官图像的量化分析
利用激光扫描共聚焦、双光子、光片等高端显微成像设备，可以拍摄到类器官标本从宏观到微观清晰的图像，帮助科研工作者观察到3D标本内部每一个细胞乃至亚细胞的精细结构。
但是对于生命科学研究来说，只是观察到标本的细节图像是不够的，在以类器官模型检验药物功效及毒理分析等实验中，还需要对类器官标本形态及内部的细胞进行定性和定量分析。例如比较多孔板中不同给药浓度下多个类器官标本之间的差异，从而获得更令人信服的统计学数据。
针对这些应用需求，奥林巴斯开发了一款专门针对微组织球与类器官等3D标本进行细胞分析的软件— Novisight。
Novisight软件界面及对不同浓度紫杉醇处理后的细胞球内部有丝分裂细胞的量化分析示例
NoviSight特别适合对多孔板内培养的细胞球或类器官等标本在复杂的3D范围内进行细胞识别、分析和统计。该软件特有的True 3D技术可帮助您真实还原样品的空间形态，而多参量测量模块可快速识别类器官及细胞组分，获取如体积、表面积、空间距离和荧光强度等数据。此外，其交互式的设计让您可以轻松地将细胞和统计数据一一对应，保证了数据统计分析时的准确性。
由于类器官在基因水平和形态特点上能够很好地模拟人体相应的组织，使其在发育模拟、疾病研究、临床免疫、肿瘤药敏、再生医学和精准医疗等领域拥有广阔的发展前景。但作为新兴技术，类器官标本培养、质量控制、实验重复性等方面依然有着局限性，因此类器官的基础研究和应用转化依然任重道远。
奥林巴斯作为一家具有百年历史的显微镜制造商, 一直致力于为广大科研工作者提供全流程的实验协助和技术支持。
我们希望通过为类器官研究提供从样本制备到3D 数据采集与分析的完整解决方案，为”实现世界人民的健康、安心和幸福生活”略尽绵薄之力。
参考文献：
[1] Fadi Jacob A Patient-Derived Glioblastoma Organoid Model and Biobank Recapitulates Inter- and Intra-tumoral Heterogeneity. Cell 180 188-204 (2020)
[2] Alexandro E. Trevino Chromatin accessibility dynamics in a model of human forebrain development. Science 367 No 6476 (2020)
[3] Oliver L. Amplification of human interneuron progenitors promotes brain tumors and neurological defects. Science 375, No 6579 (2022)
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