肠道菌群分析在幼龄动物药物安全性评价中的应用研究
肠道菌群分析在幼龄动物药物安全性评价中的应用研究
【摘要】： 肠道菌群已被认为是机体的一大重要的“功能器官”,参与机体的生长发育和体内药物的代谢过程,肠道菌群的构成与药物代谢对机体的影响密切相关。幼龄动物作为儿科药物非临床安全性评价的载体,由于其肠道菌群仍处于形成与发育阶段,与药物毒性有着密切联系,因而肠道菌群的组成在药物安全性评价中尤为重要。但目前对于幼龄动物肠道菌群的研究较少,同时也没有过多研究将肠道菌群作为一项药物安全性评价指标。目的:1.本研究拟通过对健康幼龄动物(大鼠、猴)不同年龄阶段的粪便进行肠道菌群分析,探究正常幼龄动物与成年动物肠道菌群的变化规律;2.以去壁灵芝孢子粉为例,考察给药后幼龄动物肠道菌群变化特征及其与免疫、行为学等相关幼龄动物毒理学指标的关系。方法:1.幼龄及成年动物正常肠道菌群比较分析:采集不同年龄阶段的SD大鼠(出生后45天(Postnatal Day,PND45)、PND65、PND92,雌雄各半,n分别为5、10和6)、食蟹猴(1-1.5岁、3-4岁,均雄性,n=8)的粪便,进行16S rRNA检测,对检测结果进行分析,分析不同年龄阶段(从幼龄到成年)的优势菌和肠道菌群动态规律。2.去壁灵芝孢子粉幼龄大鼠6周重复给药毒性试验及肠道菌群分析:1)PND21幼龄SD大鼠128只,雌雄各半,采用体重均衡随机分组法分为4组,即溶媒对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组,每组32只,于PND24开始分别按10m L/kg给药体积经口灌胃给予纯水、去壁灵芝孢子粉0.8 g/kg、1.8 g/kg和4.0 g/kg,每天给药1次,连续给药6周,停药后恢复观察4周。停药和恢复期结束检查时,通过检测各项常规幼龄动物毒理学指标考察去壁灵芝孢子粉对幼龄大鼠生长发育及其毒性的影响。并采集幼龄大鼠停药和恢复期结束检查时粪便,进行肠道菌群16S rRNA检测分析,寻找不同时期的差异菌,并与常规免疫毒性、行为学相关毒理学指标进行相关性分析。2)另取PND21幼龄SD大鼠60只,雌雄各半,采用体重均衡随机分组法分为3组,即溶媒对照组、低剂量组和高剂量组,每组20只,按照上述试验相同方案(仅溶媒对照、低剂量和高剂量组)进行给药,并进行T细胞依赖性抗体反应(T-cell dependent antibody response,TDAR)试验,即于去壁灵芝孢子粉给药4周、停药恢复2周时(5只/性别/时间点),各组幼龄大鼠分别尾静脉注射钥孔戚血蓝素(keyhole limpet hemocyanin,KLH)1ml/只,各时间点分别于KLH注射后1周、2周检测血清中KLH-Ig M、KLH-Ig G抗体滴度;并采集对应时期的粪便经肠道菌群分析,分析给药后TDAR指标与肠道菌群之间的关系。结果:1.幼龄及成年健康动物肠道菌群比较分析:(1)SD大鼠:基于16S rRNA测序,在正常大鼠(从幼龄到青少年到成年)肠菌的PCA、PCo A分析中发现,随着大鼠日龄的增加,肠道菌群结构发生明显变化,并逐渐趋于稳定。PND45幼龄大鼠优势菌分别为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌纲(Bacteroidia)、杆菌纲(Bacilli)、拟杆菌目(Bacteroidales)、Muribaculaceae科、乳酸杆菌科(Lactobacillaceae)、norank＿f＿Muribaculaceae属和乳杆菌属(Lactobacillus),PND65和PND92大鼠优势菌相似,两者共同优势菌为厚壁菌门、拟杆菌纲、拟杆菌目、Muribaculaceae科、norank＿f＿Muribaculaceae属。(2)食蟹猴:基于16S rRNA测序,1-1.5岁幼龄猴与3-4岁成年猴肠道菌群的PCA和PCo A分析中发现,两组间肠菌构成相似,且其在门、纲、目、科、属水平上的优势菌均相同,分别为厚壁菌门(Firmicute)、拟杆菌纲(Bacteroidia)、拟杆菌目(Bacteroidales)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、普氏菌属(Prevotella),提示1-1.5岁幼龄猴的肠道菌群丰度分布及多样性已接近成年水平。2.去壁灵芝孢子粉幼龄大鼠6周重复给药毒性试验及肠道菌群分析:(1)去壁灵芝孢子粉给药6周后,幼龄大鼠免疫指标(CD3~+CD4~+%、TDAR试验—KLH-Ig G抗体滴度)和行为学指标(Morris水迷宫—目标象限内时间百分比)明显升高,提示去壁灵芝孢子粉对免疫功能有增强调节作用,并可能提高幼龄大鼠的学习记忆能力。(2)基于16S rRNA测序分析发现,停药检查时期雄性幼龄大鼠肠道菌群多样性发生显著性改变,而在恢复期多样性无显著性变化,经PCA和PCo A分析发现两个时期雌雄幼龄大鼠肠菌组成相似。两个时期雌雄幼龄大鼠的差异菌各不相同。将差异菌与常规免疫(外周血淋巴细胞分型)和行为学指标进行相关性分析发现,停药检查时,雌雄幼龄大鼠差异菌与免疫和行为学指标之间无显著相关性,恢复期结束时,丁酸单胞菌属(Butyricimonas)、消化球菌属(Peptococcus)、和Marinifilaceae科相对丰度的降低以及普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)相对丰度的增加可能分别与雄性幼龄大鼠免疫和行为学指标变化有关;伯克氏菌目(Burkholderiales)、Parasutterella属、和Intestinimonas属相对丰度的增加以及Frisingicoccus属相对丰度的降低可能与给予去壁灵芝孢子粉后雌性幼龄大鼠免疫指标的变化有关;普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、Bacteroides＿pectinophilus＿group属、Oscillospirales目和Allobaculum属相对丰度的增加可能与给予去壁灵芝孢子粉后雌性幼龄大鼠学习记忆指标提高有关。其中Allobaculum属在给药后出现,考虑可能是提高学习记忆能力的关键菌。(3)TDAR试验中,将幼龄大鼠组间差异菌与KLH抗体滴度进行相关性分析进一步验证了肠道菌群与幼龄动物机体免疫之间的关系,发现停药检查时期Dubosiella属、杆菌纲(Bacilli)、梭菌科(Clostridiaceae)、梭菌目(Clostridiales)、Faecalibaculum属、UCG＿005属、Candidatus＿Stoquefichus属、弯曲菌属(Turicibacter)、Clostridium＿sensu＿stricto＿1属、Enterorhabdus属、双歧杆菌科(Bifidobacteriaceae)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、双歧杆菌目(Bifidobacteriales)和放线菌纲(Actinobacteria)相对丰度的降低以及Eubacterium＿ventriosum＿group属、Frisingicoccus属和丁球菌科(Butyricicoccaceae)相对丰度的增加可能与给予去壁灵芝孢子粉后雄性幼龄大鼠TDAR增强有关,其中梭菌目、双歧杆菌科/属可能为主要相关菌。结论:1.本研究对于不同年龄阶段(从幼龄到成年)SD大鼠及食蟹猴肠道菌群的构成和动态规律分析结果表明,PND45幼龄大鼠的优势菌与PND65青少年大鼠和PND92成年大鼠优势菌不同,后两者优势菌相似;1-1.5岁幼龄猴与3-4岁成年猴的肠道菌群优势菌及多样性相似。2.去壁灵芝孢子粉给药6周后对于幼龄大鼠免疫力和学习记忆能力有所增强,并且肠道菌群构成发生了明显变化;部分差异菌丰度的改变与上述幼龄毒理学指标密切相关,提示肠道菌群与幼龄动物免疫和学习记忆能力有关,为肠道菌群作为一种新的儿科药物非临床安全性评价指标提供一定的科学参考。
【学位授予单位】：浙江省医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2021
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