一种油茶自交不亲和雌性决定因子S基因的鉴定方法及配套试剂盒
本发明涉及了植物分子育种领域，具体的是一种油茶自交不亲和雌性决定因子s基因的鉴定方法及配套试剂盒。
背景技术：
1、油茶是山茶科山茶属植物中种籽富含油脂的物种的统称，是国家重点发展主要作物，在保障国家食用油安全、改善国民食用油结构中发挥重要作用，大力发展油茶产业具有增加食用油料供给、缓解耕地压力、和改善生态环境等重要意义。我国油茶产业在油茶产业发展项目、农发资金、现代农业发展扶持资金等强力支持下，发展形势持续向好。油茶林基地面积不断扩大，全国油茶林面积已由2010年的4560万亩发展到2020 年超过7100万亩。然而油茶生产中一直存在花而不实、座果率低、产量低的现象，这已成为严重制约油茶产业健康发展的瓶颈。研究表明，油茶自交不亲和性是导致油茶结实率低的重要原因之一。
2、油茶属于后期自交不亲和植物类型，目前对油茶的研究主要在优株选育，授粉技术，丰产技术等方面较多，其花多果少的内在机制的探讨和问题的解决没有得到根本的解答。后期自交不亲和植物的分子机制仍不明确，可能受 s-rnase介导。s-rnase基因是植物配子体自交不亲和的雌蕊决定因子之一。最初是在自交不亲和烟草中被鉴定，它编码一个大小为32kda的蛋白分子，且与自交不亲和s单体型共分离。利用花柱特异启动子，在矮牵牛花柱中超表达 s-rnase后，花柱可抑制相应s基因型的花粉，这充分证明了s-rnase是调控si反应唯一的雌蕊s决定因子。s-rnase遇到相同的单倍型花粉管时，会导致细胞“毒性”发生程序性死亡，而进入不同单倍型花粉管时，会触发一系列的机制消除“毒性”的影响从而导致自交不亲和的丢失。本发明拟首次对越南油茶的自交不亲和现象进行了研究，并克隆鉴定到油茶自交不亲和的s雌性决定因子s-rnase基因。在越南油茶挖掘获得s-rnase等位基因，分析其对越南油茶交配亲和性的影响，为油茶育种与生产提供科学依据。
技术实现思路
1、本发明提供一组用于鉴定油茶自交不亲和雌性决定因子s基因的引物组、试剂盒及其应用。
2、本发明的另一目的在于提供一种鉴定油茶自交不亲和雌性决定因子s基因的方法及其应用。通过对越南油茶的s-rnase基因进行扩增及克隆，鉴定出 s-rnase基因，并在越南油茶中进行群体检测，根据检测结果可对不同株系的油茶搭配授粉。
3、本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
4、一组用于鉴定油茶自交不亲和雌性决定因子s基因的引物组，包括 cvs-rnase-2引物组，所述cvs-rnase-2引物组包括，
5、正向引物(5'-3')：tccgaacactgcgtttgctg；
6、反向引物(5'-3')：acaactaaatcgcccacgcata。
7、一种用于鉴定油茶自交不亲和雌性决定因子s基因的试剂盒，包括上述 cvs-rnase-2引物组。
8、上述试剂盒中还包括，灭菌的去离子水，2×phanta max master mix。
9、一种鉴定油茶自交不亲和雌性决定因子s基因的方法，该方法以待鉴定油茶的cdna为扩增模板，采用权利要求1的cvs-rnase-2引物组中的引物对分别进行pcr扩增，根据扩增产物的有无以及大小确定待鉴定油茶自交不亲和雌性决定因子s基因。
10、为了确定上述结果的可靠性，还要进一步检测每个引物对扩增出来的片段大小，如若cvs-rnase-2引物组的引物对扩增出的片段大小为900bp，则待鉴定油茶品种的含有自交不亲和雌性决定因子s基因。
11、进一步地，所述根据扩增产物的有无以及大小确定待鉴定油茶自交不亲和雌性决定因子s基因的方法为：如果采用cvs-rnase-2引物组对待鉴定油茶的cdna进行扩增获得预期的核苷酸片段，则待鉴定油茶中含有自交不亲和雌性决定因子s基因。
12、鉴定油茶自交不亲和雌性决定因子s基因的方法，待鉴定油茶的cdna是以待鉴定油茶的根、茎、叶或花为材料提取得到的。
13、上述引物组或试剂盒在为自交不亲和油茶品种选配授粉油茶品种中的应用。
14、上述鉴定油茶自交不亲和雌性决定因子s基因的方法在为自交不亲和油茶品种选配授粉油茶品种中的应用。
15、上述的应用，确定油茶的自交不亲和雌性决定因子s基因，含有不同自交不亲和雌性决定因子s基因且所含自交不亲和雌性决定因子s基因均不相同的油茶品种可互为授粉油茶品种。
16、上述一种鉴定油茶自交不亲和雌性决定因子s基因的方法具体包括以下步骤：
17、(1)提取越南油茶总rna。
18、(2)以越南油茶总rna反转录合成的单链cdna。
19、(3)cdna为模板，使用2×phanta max master mix高保真酶扩增目标基因。
20、pcr反应体系和程序如下(50μl)：
21、
22、pcr反应程序如下：
23、预变性：95℃3min
24、pcr扩增35个循环：95℃15s，55℃15s，72℃30s
25、延伸：72℃5min
26、(4)pcr扩增结束后，使用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。扩增产物为单条带，条带大小约为900bp，为目标条带。
27、(5)用pcr产物回收试剂盒切胶回收目标条带。
28、(6)将目的片段回收产物连接到ta/blunt-zero载体载体上，具体操作为：在100μlpcr管中加入反应体系，轻弹管底混匀，低速瞬时离心收集所有液体于离心管底，37℃反应5min，将离心管置于冰上。用5μl连接反应体系：
29、5×ta/blunt-zero cloning mix 1μl
30、pcr纯化产物 1μl
31、ddh2o 3μl
32、(7)将连接产物全部加入到50μl的dh5α大肠杆菌感受态细胞中，轻柔混匀，冰浴30min。
33、(8)42℃水浴中热激45s，然后迅速冰浴5min，该过程不能摇动离心管。
34、(9)加入800μl液体lb培养基，37℃下，200r/min水平震荡培养1h。
35、(10)室温5000r/min离心5min，吸去上清液，将剩余100μl转化产物均匀的涂布于含有50μg/ml kan抗生素的固体lb培养基上细胞，37℃倒置培养过夜。
36、(11)挑取10个菌斑，加入1ml含有kan抗生素的液体lb培养基中，在37℃下，200r/min震荡培养2h，使用m13通用引物进行菌落pcr验证。
37、(12)选取5-10个阳性克隆进行双向测序、拼接得到s-rnase基因序列信息。
38、本发明的有益之处在于：本发明根据油茶自交不亲和雌性决定因子s基因，在特异区域设计出特异引物，并以此建立了pcr扩增体系，以待测不同油茶品种的cdna为模板，分别以特异引物去分析扩增结果并确定各个待测油茶品种的自交不亲和雌性决定因子s基因。我们将这些引物对配制成预混液，并搭配 2×phanta max master mix高保真酶，以及灭菌的去离子水，共同组成配套的自交不亲和雌性决定因子s基因检测试剂盒，方便使用，且操作简便，能快简单快速的鉴定出未知油茶品种的自交不亲和雌性决定因子s基因，并可根据鉴定的结果配置合适的油茶植株，为油茶杂交育种中亲本选配提供依据。
39、为让本发明的上述和其他目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合所附图式，作详细说明如下。
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