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一种低聚半乳糖生产专用酶及其制备与应用的制作方法

泰然健康网
2024-12-24 19:35

技术特征：

1.一种乳糖酶，其特征在于，所述乳糖酶氨基酸序列如序列表seqidno.2、4、6、8、10、12、14、16或18所示。

2.权利要求1所述的一种乳糖酶，其特征在于，所述乳糖酶编码基因如序列表seqidno.1、3、5、7、9、11、13、15或17所示。

3.含有权利要求2所述乳糖酶编码基因的重组载体或重组菌株。

4.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，采用的表达载体包括但不限于phy-wzx，pbl-wzx，phy300plk，pub110，pe194，pht1469，pwh1520；

或phse-001、phse-002、phse-003、phse-004、phse-005、phse-006、phse-007、phse-008、phse-009、phse-010、phse-011、phse-012、phse-013、phse-014、phse-015、phse-016、phse-017、phse-018。

5.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，采用的表达载体phse-018是以phy-wzx为基础表达载体的骨架，整合来源于地衣芽胞杆菌淀粉酶启动子pamyl和碱性蛋白酶apre的信号肽所得；

所述pamyl如seqidno.20所示，所述碱性蛋白酶apre的信号肽如seqidno.23所示。

6.如权利要求3所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株采用的表达宿主包括但不限于枯草芽胞杆菌、环状芽胞杆菌、巨大芽胞杆菌、短小芽胞杆菌、解淀粉芽胞杆菌、谷氨酸棒杆菌、地衣芽胞杆菌。

7.如权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株采用的表达宿主为突变株bcbt0529，是在地衣芽胞杆菌cbb3008，编号cctccno.m208236的基因组上敲除apre，vpr，wpr，lacr，laca，laca2，yesz基因所得；

apre，vpr，wpr，lacr，laca，laca2，yesz基因的genbank登录号分别为：mt885340、mt885341、mt885342、mt885336、mt885337、mt885338、mt885339。

8.如权利要求7所述的重组菌株，其特征在于，具体为地衣芽胞杆菌bcbtbc168d，是将seqidno.17所示的bcbg168-d编码基因整合在phse-008质粒上，并在宿主细胞突变株bcbt0529中进行表达所得。

9.权利要求3所述重组菌发酵生产乳糖酶的方法，其特征在于，摇瓶发酵生产乳糖酶：接种重组菌至摇瓶培养基，30～45℃、120-270r/min下培养2～3天；

摇瓶培养基组成：酵母膏0.5～1.5％，蛋白胨1.2～3.6％，葡萄糖8～20％；ph7.0。

10.权利要求3所述重组菌发酵生产乳糖酶的方法，其特征在于，发酵罐发酵生产乳糖酶：将菌种按接种量为5％-10％接入发酵罐培养基；发酵过程中采用发酵温度33～45℃，控制溶氧为0.1％～20％，ph为6.0～7.8，流加30％～60％麦芽糖浆并维持还原糖含量在0.1％-5％；发酵持续90～120h，发酵终点控制为发酵酶活增加值小于5-20u/(ml·h)。

发酵罐培养基组成为：麦芽糖浆1％～5％，棉籽粉0％～5％，玉米浆0％-4％，豆饼粉0.5～5％，硫酸铵0.1～5％，ph6.0～8.0。

11.权利要求9或10所述重组菌发酵生产乳糖酶的方法，其特征在于，发酵结束后，经板框过滤除去菌体，再经超滤系统过滤后获得酶液。

12.权利要求3所述重组载体或重组菌株在生产乳糖酶中的应用。

13.权利要求1或2所述乳糖酶在生产低聚半乳糖中的应用。

技术总结
本发明属于酶工程技术领域，具体涉及生成低聚半乳糖的乳糖酶及其制备和应用。本发明以两种来源的乳糖酶(来源于环状芽胞杆菌B2301的BglD305和来源于环状芽胞杆菌ATCC 31382的BglD)分子为基础进行分子进化，获得合成低聚半乳糖效率高、表达性能好的乳糖酶新酶分子；并构建乳糖酶高产菌株，能够在深层发酵时高效合成乳糖酶并将酶蛋白分子分泌到培养基中，从发酵上清中直接制备高活性的酶制剂，乳糖酶的表达水平可以达到2208U/mL，有助于降低乳糖酶的发酵制造成本、简化发酵制造工艺并提高乳糖酶酶制剂的质量。

技术研发人员：王正祥;牛丹丹;田康明
受保护的技术使用者：天津科技大学
技术研发日：2020.09.29
技术公布日：2021.03.30