一种番石榴叶内生菌的分离方法与流程
本发明属于生物
技术领域：
，尤其涉及一种内生菌的分离方法。
背景技术：
内生菌是指生活史全部阶段或者部分阶段生活在活的植物组织内，而同时又不引起植物明显病害症状的微生物。“内共生理论”认为与宿主共同进化的内生菌可能从宿主中获得相关基因的传递，具有合成与宿主相同或相似代谢产物的能力。1993年，首次从短叶红豆杉中分离得到一株能够产生抗癌物质—紫杉醇的内生真菌，进一步证实了“内共生理论”。植物内生菌产生的次级代谢产物是天然药用活性物质的重要来源，而且很大一部分天然产物是新型生物活性物质，具有广阔的应用前景。由于植物内生菌繁殖速度快、产生代谢产物种类多，加强对植物内生菌的开发和利用，是寻找和开发新药物的良好途径，具有良好的应用前景和开发利用价值。番石榴叶中含有丰富的营养物质，新鲜成熟的番石榴叶中含有较高的蛋白质和可溶性糖。同时含有黄酮类、多酚类、三萜类、杂源萜类、挥发油、植物多糖等功能活性成分。研究表明番石榴叶提取物具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗微生物、抗腹泻、抗肿瘤及保护肝脏的作用。现有技术中公布的内生菌分离方法并不能很好的适用于番石榴叶内生菌的分离，研究开发一种从番石榴叶中高效分离内生菌的方法能显著扩大番石榴的应用范围，具有广阔的市场价值。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是克服以上
背景技术：
中提到的不足和缺陷，提供一种番石榴叶内生菌的分离方法，该方法特别适用于番石榴叶，其内生菌的分离效果更好。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：一种番石榴叶内生菌的分离方法，包括以下步骤：(1)在夏季采集具有10年以上树龄的新鲜番石榴老叶，低温放置(在4℃下放置24h)；10年以上树龄的番石榴老叶具有的内生菌种类最多的特点，且夏季树叶生长茂盛是采集番石榴叶的最好的时期；番石榴叶在低温保存24h后，表面的微生物会受到抑制，有利于叶片表面消毒；(2)对番石榴老叶进行表面灭菌处理得到备用叶片；表面灭菌处理的目的在于除去叶片表面的杂菌；(3)将步骤(2)中得到的备用叶片剪碎后，加入生理盐水与纤维素酶后研磨成匀浆，将匀浆稀释后涂布到培养平板上培养；将匀浆稀释后涂布到培养平板上培养；番石榴叶为革质叶片，质地较坚固，研磨时加入一定量的纤维素酶可以分解植物纤维及细胞壁，可以促进内生菌的浸出；(4)待培养平板上长出菌落时，挑选单菌落，进行划线分离纯化，即得到番石榴叶内生菌。上述分离方法中，优选的，表面灭菌处理包括以下步骤：用自来水冲洗步骤(1)中经低温放置后的番石榴叶，将叶片放在无菌水中浸泡，同时加入2-3滴洗洁精，使用磁力搅拌仪低速搅拌30-60min，剔除损伤叶片后，用无菌水洗去叶片上残留的洗洁精；再将叶片用0.2-0.4％的二氧化氯溶液浸泡1-3min，用无菌水冲洗干净；最后将叶片用无菌水浸没在封闭容器中后放入超声消毒机，在10-15khz、80-150w条件下，消毒10-20min，再用无菌水冲洗，吸干叶片表面的水分即得到备用叶片。番石榴本身具有抑菌活性，叶片表面上的微生物数量较少，可以用较低消毒剂的浓度和较短的消毒时间，同样可以达到表面消毒的目的，同时可以减弱消毒剂的渗透效果，避免内生菌受到伤害。为了保证消毒效果可以辅助使用超声消毒机，超声波处理可以降低消毒剂的残留，同时通过剪切力作用可以破碎植物细胞，加强破壁效果，可以促进内生菌的浸出。上述分离方法中，优选的，所述步骤(3)中，控制所述备用叶片与纤维素酶的质量比为1000：(0.8-1.2)。采用上述质量比的纤维素酶，可以保证内生菌的浸出效果最佳。上述分离方法中，优选的，所述步骤(2)与步骤(3)之间还有消毒效果检验过程，所述消毒效果检验过程中使用的检验方法包括漂洗对照、印迹对照和环境对照3种方法。所述漂洗对照是取最后一次漂洗无菌水100ul涂布在分离平板上，每个样品重复3次；所述印迹对照是取消毒后的材料放在分离培养基上10min后再将培养基进行培养；所述环境对照是在整个内生菌分离过程中，放置3个开盖的培养平板于操作环境中，分离结束后进行培养。同时使用3种对照方法，可以确保获得的菌株一定是内生菌。上述分离方法中，优选的，所述步骤(3)中匀浆稀释后涂布到培养平板上培养是指：将匀浆用无菌水分别稀释1倍、10倍、100倍、1000倍，分别取100ul稀释液涂布于分离平板上，每个处理重复3次，在30℃下恒温培养3-12d。上述分离方法中，优选的，所述分离平板包括内生真菌培养基、内生细菌培养基和内生放线菌培养基，所述内生真菌培养基使用pda培养基，内生细菌培养基使用na培养基，内生放线菌培养基使用高氏一号培养基，且所述内生真菌培养基、内生细菌培养基和内生放线菌培养基中均添加有番石榴叶浸出液。在培养过程中在培养基中加入少量的番石榴叶浸出液，可以提供内生菌的更适的生长环境，可以最大程度的分离到番石榴叶的内生菌。匀浆的成分是一致的，在匀浆里有各种微生物，通过不同的培养基(即分离平板)可以培养出不同的优势菌。分离平板包括三种不同的分离培养用平板，每种平板适合不同的微生物，pda适合真菌的生长，na适合细菌的生长，高氏一号适合放线菌的生长，可以在不同的培养基上，通过形态学表面特征鉴定出不同类型的微生物，再通过步骤(4)的划线分离纯化即可得到纯度很高的、不同种类的番石榴叶内生菌。上述分离方法中，优选的，所述番石榴叶浸出液的制备过程包括以下步骤：将番石榴叶片剪碎，与蒸馏水以体积比1：1的方式混合，煮沸后，小火熬煮30min，过滤获得清液即为番石榴叶浸出液。上述分离方法中，优选的，所述内生真菌培养基、内生细菌培养基和内生放线菌培养基中添加的番石榴叶浸出液的体积占培养基体积的6-8％。上述番石榴叶浸出液的加入量可以保证内生菌的生长，其用量需要得到精确控制，用量过多与过少均不适合番石榴的生长。与现有技术相比，本发明的优点在于：1、本发明针对番石榴叶的特性，在采集样品的环节较细致，保证采集的番石榴叶内生菌是处于种类和数量最多的时期，最终得到的内生菌种类与数量最多。2、在研磨过程中，针对番石榴叶纤维素含量较高和细胞壁较厚的特点，添加一定量的纤维素酶可以加强破壁效果和效率，促进内生菌的浸出。3、在内生菌的分离培养基中添加一定量的番石榴叶浸出液，可以一定程度的模拟番石榴叶内生菌的培养条件，可以获得更多的内生菌。4、本发明的方法特别适合于从番石榴叶中分离内生菌，其工艺步骤简单，操作方便。具体实施方式为了便于理解本发明，下文将结合较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。实施例1：一种番石榴叶内生菌的分离方法，包括以下步骤：(1)番石榴叶的采集及低温保存：在夏季，采集具有10年以上树龄的新鲜、健康的番石榴老叶，将采摘的番石榴叶片，在4℃下放置24h；(2)番石榴叶的预处理和表面消毒：取采集的番石榴叶片，用自来水冲洗，并用毛刷轻轻刷去叶片表面的泥土等杂质，将叶片放在无菌水中浸泡，同时加入2-3滴洗洁精，用磁力搅拌装置搅拌30min，剔除其中的损伤叶片，用无菌水冲洗5次，去掉残留洗洁精，再将叶片用0.2％的二氧化氯溶液浸泡3min，用无菌水冲洗5次；番石榴叶放入密封的玻璃容器中，用无菌水浸没，使用超声消毒机在10khz、80w条件下，消毒10min，再用无菌水冲洗5次，使用无菌吸水纸吸干，得到备用叶片；(3)检验消毒效果：检验表面消毒的番石榴叶消毒效果，作为分离内生菌的对照，同时使用漂洗对照、印迹对照和环境对照3种方法；(4)内生菌的浸出和培养：取表面消毒灭菌后的番石榴叶片0.5g，使用无菌剪刀剪碎，放入无菌的研钵，加入10ml无菌生理盐水，加入0.4mg纤维素酶研磨成匀浆，将研磨后的匀浆梯度稀释10-103倍，各取100ul涂布到培养平板，在30℃下，培养3d；使用不同的培养基分别加入6％的番石榴叶浸出液，内生细菌使用na培养基，内生放线菌使用高氏一号培养基，内生真菌使用pda培养基；其中，番石榴叶浸出液的制备过程包括以下步骤：将番石榴叶片剪碎，与蒸馏水以体积比1：1的方式混合，煮沸后，小火熬煮30min，过滤获得清液即为番石榴叶浸出液；(5)内生菌的分离纯化：待培养平板上长出菌落时，根据菌落的不同形态特征，挑选出其中的单菌落，平板划线培养，纯化后移入试管斜面保存。实施例2：一种番石榴叶内生菌的分离方法，包括以下步骤：(1)番石榴叶的采集及低温保存：在夏季，采集具有10年以上树龄的新鲜、健康的番石榴老叶，将采摘的番石榴叶片，在4℃下放置24h；(2)番石榴叶的预处理和表面消毒：取采集的番石榴叶片，用自来水冲洗，并用毛刷轻轻刷去叶片表面的泥土等杂质，将叶片放在无菌水中浸泡，同时加入2-3滴洗洁精，用磁力搅拌装置搅拌30min，剔除其中的损伤叶片，用无菌水冲洗5次，去掉残留洗洁精，再将叶片用0.3％的二氧化氯溶液浸泡1min，用无菌水冲洗5次；番石榴叶放入密封的玻璃容器中，用无菌水浸没，使用超声消毒机在10khz、80w条件下，消毒10min，再用无菌水冲洗5次，使用无菌吸水纸吸干，得到备用叶片；(3)检验消毒效果：检验表面消毒的番石榴叶消毒效果，作为分离内生菌的对照，同时使用漂洗对照、印迹对照和环境对照3种方法；(4)内生菌的浸出和培养：取表面消毒灭菌后的番石榴叶片0.5g，使用无菌剪刀剪碎，放入无菌的研钵，加入10ml无菌生理盐水，加入0.5mg纤维素酶研磨成匀浆，将研磨后的匀浆梯度稀释10-103倍，各取100ul涂布到培养平板，在30℃下，培养7d；使用不同的培养基分别加入7％的番石榴叶浸出液，内生细菌使用na培养基，内生放线菌使用高氏一号培养基，内生真菌使用pda培养基；(5)内生菌的分离纯化：待培养平板上长出菌落时，根据菌落的不同形态特征，挑选出其中的单菌落，平板划线培养，纯化后移入试管斜面保存。实施例3：一种番石榴叶内生菌的分离方法，包括以下步骤：(1)番石榴叶的采集及低温保存：在夏季，采集具有10年以上树龄的新鲜、健康的番石榴老叶，将采摘的番石榴叶片，在4℃下放置24h；(2)番石榴叶的预处理和表面消毒：取采集的番石榴叶片，用自来水冲洗，并用毛刷轻轻刷去叶片表面的泥土等杂质，将叶片放在无菌水中浸泡，同时加入2-3滴洗洁精，用磁力搅拌装置搅拌30min，剔除其中的损伤叶片，用无菌水冲洗5次，去掉残留洗洁精，再将叶片用0.2％的二氧化氯溶液浸泡1min，用无菌水冲洗5次；番石榴叶放入密封的玻璃容器中，用无菌水浸没，使用超声消毒机在10khz、80w条件下，消毒10min，再用无菌水冲洗5次，使用无菌吸水纸吸干，得到备用叶片；(3)检验消毒效果：检验表面消毒的番石榴叶消毒效果，作为分离内生菌的对照，同时使用漂洗对照、印迹对照和环境对照3种方法；(4)内生菌的浸出和培养：取表面消毒灭菌后的番石榴叶片0.5g，使用无菌剪刀剪碎，放入无菌的研钵，加入10ml无菌生理盐水，加入0.6mg纤维素酶研磨成匀浆，将研磨后的匀浆梯度稀释10-103倍，各取100ul涂布到培养平板，在30℃下，培养12d；使用不同的培养基分别加入8％的番石榴叶浸出液，内生细菌使用na培养基，内生放线菌使用高氏一号培养基，内生真菌使用pda培养基；(5)内生菌的分离纯化：待培养平板上长出菌落时，根据菌落的不同形态特征，挑选出其中的单菌落，平板划线培养，纯化后移入试管斜面保存。实施例4：一种番石榴叶内生菌的分离方法，包括以下步骤：(1)番石榴叶的采集及低温保存：在夏季，采集具有10年以上树龄的新鲜、健康的番石榴老叶，将采摘的番石榴叶片，在4℃下放置24h；(2)番石榴叶的预处理和表面消毒：取采集的番石榴叶片，用自来水冲洗，并用毛刷轻轻刷去叶片表面的泥土等杂质，将叶片放在无菌水中浸泡，同时加入2-3滴洗洁精，用磁力搅拌装置搅拌30min，剔除其中的损伤叶片，用无菌水冲洗5次，去掉残留洗洁精，再将叶片用0.2％的二氧化氯溶液浸泡2min，用无菌水冲洗5次；番石榴叶放入密封的玻璃容器中，用无菌水浸没，使用超声消毒机在10khz、80w条件下，消毒10min，再用无菌水冲洗5次，使用无菌吸水纸吸干，得到备用叶片；(3)检验消毒效果：检验表面消毒的番石榴叶消毒效果，作为分离内生菌的对照，同时使用漂洗对照、印迹对照和环境对照3种方法；(4)内生菌的浸出和培养：取表面消毒灭菌后的番石榴叶片0.5g，使用无菌剪刀剪碎，放入无菌的研钵，加入10ml无菌生理盐水，加入0.6mg纤维素酶研磨成匀浆，将研磨后的匀浆梯度稀释10-103倍，各取100ul涂布到培养平板，在30℃下，培养12d；使用不同的培养基分别加入8％的番石榴叶浸出液，内生细菌使用na培养基，内生放线菌使用高氏一号培养基，内生真菌使用pda培养基；(5)内生菌的分离纯化：待培养平板上长出菌落时，根据菌落的不同形态特征，挑选出其中的单菌落，平板划线培养，纯化后移入试管斜面保存。实施例5：一种番石榴叶内生菌的分离方法，包括以下步骤：(1)番石榴叶的采集及低温保存：在夏季，采集具有10年以上树龄的新鲜、健康的番石榴老叶，将采摘的番石榴叶片，在4℃下放置24h；(2)番石榴叶的预处理和表面消毒：取采集的番石榴叶片，用自来水冲洗，并用毛刷轻轻刷去叶片表面的泥土等杂质，将叶片放在无菌水中浸泡，同时加入2-3滴洗洁精，用磁力搅拌装置搅拌30min，剔除其中的损伤叶片，用无菌水冲洗5次，去掉残留洗洁精，再将叶片用0.2％的二氧化氯溶液浸泡1min，用无菌水冲洗5次；番石榴叶放入密封的玻璃容器中，用无菌水浸没，使用超声消毒机在15khz、140w条件下，消毒18min，再用无菌水冲洗5次，使用无菌吸水纸吸干，得到备用叶片；(3)检验消毒效果：检验表面消毒的番石榴叶消毒效果，作为分离内生菌的对照，同时使用漂洗对照、印迹对照和环境对照3种方法；(4)内生菌的浸出和培养：取表面消毒灭菌后的番石榴叶片0.5g，使用无菌剪刀剪碎，放入无菌的研钵，加入10ml无菌生理盐水，加入0.6mg纤维素酶研磨成匀浆，将研磨后的匀浆梯度稀释10-103倍，各取100ul涂布到培养平板，在30℃下，培养12d；使用不同的培养基分别加入8％的番石榴叶浸出液，内生细菌使用na培养基，内生放线菌使用高氏一号培养基，内生真菌使用pda培养基；(5)内生菌的分离纯化：待培养平板上长出菌落时，根据菌落的不同形态特征，挑选出其中的单菌落，平板划线培养，纯化后移入试管斜面保存。实施例6：一种番石榴叶内生菌的分离方法，包括以下步骤：(1)番石榴叶的采集及低温保存：在夏季，采集具有10年以上树龄的新鲜、健康的番石榴老叶，将采摘的番石榴叶片，在4℃下放置24h；(2)番石榴叶的预处理和表面消毒：取采集的番石榴叶片，用自来水冲洗，并用毛刷轻轻刷去叶片表面的泥土等杂质，将叶片放在无菌水中浸泡，同时加入2-3滴洗洁精，用磁力搅拌装置搅拌30min，剔除其中的损伤叶片，用无菌水冲洗5次，去掉残留洗洁精，再将叶片用0.2％的二氧化氯溶液浸泡1min，用无菌水冲洗5次；番石榴叶放入密封的玻璃容器中，用无菌水浸没，使用超声消毒机在10khz、80w条件下，消毒10min，再用无菌水冲洗5次，使用无菌吸水纸吸干，得到备用叶片；(3)检验消毒效果：检验表面消毒的番石榴叶消毒效果，作为分离内生菌的对照，同时使用漂洗对照、印迹对照和环境对照3种方法；(4)内生菌的浸出和培养：取表面消毒灭菌后的番石榴叶片0.5g，使用无菌剪刀剪碎，放入无菌的研钵，加入10ml无菌生理盐水，加入0.5mg纤维素酶研磨成匀浆，将研磨后的匀浆梯度稀释10-103倍，各取100ul涂布到培养平板，在30℃下，培养12d；使用不同的培养基分别加入7％的番石榴叶浸出液，内生细菌使用na培养基，内生放线菌使用高氏一号培养基，内生真菌使用pda培养基；(5)内生菌的分离纯化：待培养平板上长出菌落时，根据菌落的不同形态特征，挑选出其中的单菌落，平板划线培养，纯化后移入试管斜面保存。实施例7：一种番石榴叶内生菌的分离方法，包括以下步骤：(1)番石榴叶的采集及低温保存：在夏季，采集具有10年以上树龄的新鲜、健康的番石榴老叶，将采摘的番石榴叶片，在4℃下放置24h；(2)番石榴叶的预处理和表面消毒：取采集的番石榴叶片，用自来水冲洗，并用毛刷轻轻刷去叶片表面的泥土等杂质，将叶片放在无菌水中浸泡，同时加入2-3滴洗洁精，用磁力搅拌装置搅拌30min，剔除其中的损伤叶片，用无菌水冲洗5次，去掉残留洗洁精，再将叶片用0.2％的二氧化氯溶液浸泡1min，用无菌水冲洗5次；番石榴叶放入密封的玻璃容器中，用无菌水浸没，使用超声消毒机在10khz、80w条件下，消毒10min，再用无菌水冲洗5次，使用无菌吸水纸吸干，得到备用叶片；(3)检验消毒效果：检验表面消毒的番石榴叶消毒效果，作为分离内生菌的对照，同时使用漂洗对照、印迹对照和环境对照3种方法；(4)内生菌的浸出和培养：取表面消毒灭菌后的番石榴叶片0.5g，使用无菌剪刀剪碎，放入无菌的研钵，加入10ml无菌生理盐水，加入0.7mg纤维素酶研磨成匀浆，将研磨后的匀浆梯度稀释10-103倍，各取100ul涂布到培养平板，在30℃下，培养12d；使用不同的培养基分别加入8％的番石榴叶浸出液，内生细菌使用na培养基，内生放线菌使用高氏一号培养基，内生真菌使用pda培养基；(5)内生菌的分离纯化：待培养平板上长出菌落时，根据菌落的不同形态特征，挑选出其中的单菌落，平板划线培养，纯化后移入试管斜面保存。对比例1：一种番石榴叶内生菌的分离方法，包括以下步骤：(1)番石榴叶的采集及低温保存：在夏季，采集具有10年以上树龄的新鲜、健康的番石榴老叶，将采摘的番石榴叶片，在4℃下放置24h；(2)番石榴叶的预处理和表面消毒：取采集的番石榴叶片，用自来水冲洗，并用毛刷轻轻刷去叶片表面的泥土等杂质，将叶片放在无菌水中浸泡，同时加入2-3滴洗洁精，用磁力搅拌装置搅拌30min，剔除其中的损伤叶片，用无菌水冲洗5次，去掉残留洗洁精，再使用75％的乙醇浸泡3min，无菌水冲洗5次，再使用3％的次氯酸钠浸泡5min，再用无菌水冲洗5次，使用无菌吸水纸吸干，得到备用叶片；(3)-(5)与实施例3的步骤(3)-(5)相同。对比例2：一种番石榴叶内生菌的分离方法，包括以下步骤：(1)-(3)与实施例3的步骤(1)-(3)相同；(4)内生菌的浸出和培养：取表面消毒灭菌后的番石榴叶片0.5g，使用无菌剪刀剪碎，放入无菌的研钵，加入10ml无菌生理盐水，加入0.6mg纤维素酶研磨成匀浆，将研磨后的匀浆梯度稀释10-103倍，各取100ul涂布到培养平板，在30℃下，培养12d；使用不同的培养基不加入番石榴叶浸出液，内生细菌使用na培养基，内生放线菌使用高氏一号培养基，内生真菌使用pda培养基；(5)内生菌的分离纯化：待培养平板上长出菌落时，根据菌落的不同形态特征，挑选出其中的单菌落，平板划线培养，纯化后移入试管斜面保存。对比例3：一种番石榴叶内生菌的分离方法，包括以下步骤：(1)-(3)与实施例3的步骤(1)-(3)相同；(4)内生菌的浸出和培养：取表面消毒灭菌后的番石榴叶片0.5g，使用无菌剪刀剪碎，放入无菌的研钵，加入10ml无菌生理盐水，不加入纤维素酶，研磨成匀浆，将研磨后的匀浆梯度稀释10-103倍，各取100ul涂布到培养平板，在30℃下，培养12d；使用不同的培养基分别加入8％的番石榴叶浸出液，内生细菌使用na培养基，内生放线菌使用高氏一号培养基，内生真菌使用pda培养基；(5)内生菌的分离纯化：待培养平板上长出菌落时，根据菌落的不同形态特征，挑选出其中的单菌落，平板划线培养，纯化后移入试管斜面保存。实施例1-7与对比例1-3中消毒效果与最终得到的内生菌种类总量经测试结果如下表1所示。表1：实施例1-7与对比例1-3中消毒效果与内生菌种类总量消毒效果细菌种类放线菌种类真菌种类内生菌种类总量实施例1无菌1712332实施例2无菌1514837实施例3无菌18141042实施例4无菌17131040实施例5无菌18141042实施例6无菌1614838实施例7无菌1513836对比例1无菌94619对比例2无菌124521对比例3无菌133723由表1可知，采用实施例1-7中的分离方法得到的内生菌种类总量明显多于对比例1-3中的分离方法。当前第1页12
相关知识
【番石榴叶】番石榴叶的功效与作用
【石榴叶】石榴叶的功效与作用及食用方法
番石榴叶的功效与作用禁忌
番石榴叶子的功效
番石榴叶的功效与作用 详解番石榴叶的4大功效
番石榴叶泡水喝的功效与作用
番石榴叶的营养价值和功效
番石榴叶的好处
番石榴叶的作用与功效
番石榴叶对健康的益处
网址: 一种番石榴叶内生菌的分离方法与流程 https://m.trfsz.com/newsview469608.html
