茶汤抗氧化活性的测定综合化学实验的研究
Study on a Comprehensive Chemical Experiment: Determination of Antioxidant Activity of Tea Soup
Yan Zankai ,, Zheng Liling
茶在中国有着非常悠久的历史，就茶的冲泡而言，潮州的工夫茶堪称一绝[1, 2]。在冲泡过程中，茶叶中的主要抗氧化活性成分茶多酚不断溶出，长期饮茶则有益于身体健康[3]。就工夫茶的茶汤品质而言，传统的评价方式是感观指标，由于饮茶人对茶汤的浓烈、淡雅存在不同的喜好，自然评价标准不一，导致冲泡茶时工艺条件因人而异。论茶的沏泡技艺，古代有斗茶文化，今天我们又如何科学饮茶呢？带着这个问题，本文以潮州工夫茶文化为背景，介绍一个以茶汤抗氧化活性为评判指标，优化冲泡条件的综合化学实验。首先指导学生收集民间泡茶的工艺条件，制订出优化茶冲泡的工艺方案；其次通过查阅科学文献资料，设计出茶汤抗氧化活性的测定步骤，并开展实验；最后分析实验数据，得出茶汤的抗氧化活性与冲泡工艺条件间的相关规律，撰写小论文。整个实验项目集化学、食品、生物等学科知识为一体，学生经历文献检索、方案设计、实验操作、数据分析、撰写论文等诸多环节的一体化训练，能有效地发展学生的综合实践素养，达成课程育人目标。
1 实验目的
(1)通过文献调研，了解工夫茶文化，收集民间冲泡茶的工艺条件；
(2)熟悉植物多酚抗氧化活性的测定方法及原理，并设计出实验方案；
(3)掌握分光光度计的操作技术及样品的采集、分析，数据处理等方法；
(4)养成敢于面对困难，严谨务实、精益求精的科学态度。
2 实验原理
(1)还原能力的测定：以普鲁士蓝Fe4[Fe(CN)6]生成量作为指标。抗氧化剂将赤血盐K3Fe(CN)6还原成黄血盐，再利用Fe2+形成普鲁士蓝，在700 nm处的吸光值反映普鲁士蓝的生成量，吸光度值越高，样品还原力(抗氧化能力)愈强，表示抗氧化效果愈佳。
(2)清除DPPH∙ (1, 1-二苯基-2-苦肼基)的测定：DPPH∙乙醇溶液呈紫色，在517 nm有强吸收，加入抗氧化剂后，抗氧化剂与DPPH∙反应，使反应体系颜色变淡，吸光度A值减少，由此可计算抗氧化剂清除DPPH∙的能力。
(3)清除∙OH能力的测定：反应生成的∙OH进攻水杨酸分子上的苯环，生成有色产物，在510 nm波长处有较强吸收，反应体系中若加入具有清除∙OH作用的物质可降低该吸光度。因此，通过测定有色物质含量来测定抗氧化剂清除∙OH的能力。
(4)清除∙O2−能力的测定：在弱碱性环境下，邻苯三酚发生自氧化反应，不断生成∙O2− (超氧阴离子自由基)及有色中间产物。抗氧化剂将∙O2−歧化分解为H2O2和O2，从而抑制了邻苯三酚的自氧化反应。中间产物累积浓度会引起波长325 nm处吸光度值的变化，由此可测得清除∙O2−的能力。
3 仪器与材料
(1) 仪器：752N型紫外可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)，FA2004N型电子天平(上海精密科学仪器有限公司)，数显恒温水浴锅(常州市华谱达教学仪器有限公司)，SJT-018A电热壶(潮州市彩塘适特电器配件厂)。
(2)试剂：1, 1-二苯基-2-苦肼基DPPH (1, 1-diphenyl-2-picryl-hydrazyl)，无水乙醇，硫酸亚铁，H2O2，水杨酸，铁氰化钾，三氯乙酸，三氯化铁，磷酸氢二钠，磷酸二氢钾，盐酸，碳酸钠等，以上试剂均为分析纯试剂，由潮州市化学试剂公司供货。
(3)材料：黄枝香凤凰单枞，当年春茶，产自广东省潮州市风凰山区。
4 实验步骤
4.1 茶汤样品的制备
(1)料液比：准确称取0.50 g茶叶6份，分别按固液比1 : 50、1 : 100、1 : 150、1 : 200、1 : 250、1 : 300 (g∙mL−1)加入90 ℃的蒸馏水，在90 ℃下保温30 min，过滤，收集滤液，即得待测液。
(2)冲泡温度：准确称取0.50 g茶叶6份，按固液比1 : 200 (g∙mL−1)分别加入60、70、80、90、100 ℃的蒸馏水，按加入的水温各保温30 min，过滤，收集滤液，即得待测液。
(3)冲泡时间：准确称取0.50 g茶叶6份，按固液比1 : 200 (g∙mL−1)都加入90 ℃的蒸馏水100 mL，在90 ℃下分别保温10、20、30、40、50、60 min，过滤，收集滤液，即得待测液。
4.2 茶汤抗氧化活性的测定
(1)茶汤还原力测定：按参考文献[4]的方法，将采用稀释10倍的茶汤作为样品。精确移取2.50 mL样品液，向其中加入磷酸缓冲溶液(0.2 mol∙L−1，pH = 6.6)、1%铁氰化钾溶液各2.50 mL，在50 ℃下保温水浴20 min后，冰浴终止反应。加10%三氯乙酸溶液2.50 mL，3000 r∙min−1离心10 min，取上清液2.50 mL，再加2 mL蒸馏水和0.1%三氯化铁溶液0.50 mL，静置10 min，在700 nm波长处测定吸光度(A)，每组试验平行3次，实验结果取平均值。计算总还原力的公式如下：
(2)清除DPPH∙能力测定：按参考文献[5]中的方法，采用稀释10倍的茶汤作为样品。准确称取0.1984 g DPPH，用无水乙醇溶解后定容至50 mL用作储备液。吸取DPPH储备液2 mL，用无水乙醇定容至100 mL。分别吸取2 mL DPPH溶液和2 mL无水乙醇于试管中，用力摇匀，避光反应30 min，在波长517 nm处测定其吸光值(A0)。另取试管，用2 mL茶汤替代无水乙醇，测定其吸光值(Ai)；再取试管，用2 mL茶汤替代DPPH溶液，测定其吸光值(Aj)。每组试验平行3次，实验结果取平均值。计算DPPH的清除率公式如下：
PPH清除率 =A0−(Ai−Aj)A0×100%
(2)
(3)茶汤清除∙OH能力测定：按参考文献[6]的方法进行实验，将采用稀释10倍的茶汤作为样品。精确吸取1 mL FeSO4 (9 mmol∙L−1)、1 mL水杨酸-乙醇(9 mmol∙L−1)和茶汤1 mL。再加入1 mL H2O2 (8.8 mmol∙L−1)，在37 ℃下保温反应0.5 h，在波长510 nm处测定吸光度(Ax)。计算∙OH清除率的公式如下：
· OH 清除率 =A0−(Ax−Ax0)A0×100%
(3)
式中：A0，样品空白时吸光度；Ax，加入茶样后吸光度；Ax0，不加显色剂H2O2、加茶样的吸光度。
(4)茶汤清除超氧阴离子测定：参考文献[7]的方法，将采用稀释10倍的茶汤作为样品。取2.50 mL、50 mmol∙L−1的磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH = 8.34)，加入2 mL样品溶液，再加入0.25 mL的邻苯三酚(10 mmol∙L−1)，在25 ℃下保温4 min，加入10 mo∙L−1 HCl 1滴，终止反应；用相同的样品液为参比，在波长325 nm处测其吸光度值，得到样品的吸光度值(A1)。用蒸馏水代替样品溶液，加入与测试样品相同的其它试剂，以pH = 8.34的PBS溶液做参比，在波长325 nm处测其吸光度值，得到空白吸光度值(A0)。计算超氧阴离子的消除率的公式如下：
超氧阴离子清除率 (%)=A0−A1A0×100%
(4)
5 结果与讨论
5.1 茶水比对茶汤抗氧化活性的影响
在茶水比对茶汤的抗氧化能力的考查实验中，设定冲泡温度90 ℃、冲泡时间30 min的条件不变，过滤后得到原始茶汤。由于固液比不同，原始茶汤浓淡不同，直接取样实验，茶汤的抗氧化能力体现的只是原始茶汤单位体积的抗氧化能力，即茶汤的局部抗氧化能力。这样的比较是片面的，只反映了茶汤局部浓淡的作用，只有将茶汤定容，所有茶汤样的体积一致，这时取样比较，才可以反映茶汤的总体抗氧化能力。
为了弄清固液比对茶汤总的抗氧化能力的影响，实验将全部的原始茶汤先定容至300 mL，再稀释10倍，在等同体积下进行比较，即茶汤总抗氧化能力的比较，实验结果见图 1和图 2。从实验结果可知，随固液比的比值增大，茶汤的总体还原能力不断上升。而对自由基的清除实验则出现各自的特点，DPPH∙的清除率随固液比一直上升，但在1 : 200 (g∙mL−1)后明显变缓；O2−的清除率随固液比的比值增大，在1 : 250 (g∙mL−1)处出现一个峰值；∙OH则在1 : 150 (g∙mL−1)处出现峰值。综合几个因素的考核结果，可以得出：固液比在1 : 150–1: 250 (g∙mL−1)范围内，所得茶汤总体抗氧化能力的较强。
图1
图2
5.2 冲泡时间对茶汤抗氧化活性的影响
冲泡茶时的固液比选择1 : 200 (g∙mL−1)，冲泡温度固定为90 ℃，实验结果见图 3和图 4。随着冲泡时间的增加，茶汤的还原力逐渐上升；当时间超过40 min后，上升趋势变缓。羟基自由基的清除曲线与还原能力曲线走势一致，但清除自由基的能力较弱。在对DPPH∙和超氧阴离子自由基的清除实验中，当时间为40 min时出现峰值，形成一个倒V型走势。从实验结果可以看出，当固液比1 : 200 (g∙mL−1)，冲泡温度90 ℃，冲泡茶的时间在30–40 min时，所得茶汤的抗氧化能力较强。
图3
图4
5.3 冲泡水温对茶汤抗氧化活性的影响
实验设定固液比1 : 200 (g∙mL−1)，冲泡时间为30 min不变，考查温度对茶汤抗氧化能力的影响，实验数据见图 5和图 6。随着冲泡温度的升高，茶汤的还原能力逐渐上升，到90 ℃时达到峰值。同样，随着冲泡温度的升高，自由基的清除率不断上升；其中，DPPH∙和O2−的清除率在90 ℃时达到峰值，而羟基自由基的清除率在90 ℃时接近峰值。从实验结构可知，茶叶冲泡温度在90 ℃时茶汤的抗氧化活性较强。
图5
图6
综合上述研究结果，本实验通过冲泡茶提取茶汤，以茶汤的抗氧化能力为指标，得出工夫茶的较优冲泡方法为：按茶水固液比1:200 (g∙mL−1)投料，在温度90 ℃，冲泡时间为30–40 min时，实验达到预期研究目标。
6 实验运行情况
为保证高质量完成实验教学任务，应统筹安排好以下几个方面。
(1)教学管理。本综合设计性实验是由教师的科研成果开发而成，经学院教学委员会审核通过后，方对学生开课。教学采用科研项目管理的形式进行，以学生为主体、教师为辅导。教师采用一对一方式服务学生，全程跟踪每位学生的实验过程，确保达到预期的教学目标。
(2)实验筹备。首先教师给学生讲明实验目的、教学内容、教学计划、质量要求等事项，要求每位学生制订一个自己的实验工作计划。其次要求学生查阅工夫茶相关的文献资料，了解茶、茶文化、冲泡茶相关的知识，收集民间冲泡工艺的相关数据。其次在教师指导下，学生查阅植物多酚抗氧化活性的测定方法及原理的相关资料，依据实验室条件，撰写实验方案，包括实验操作步骤、所需的仪器及材料等。方案经教师审核通过后，学生方可进入实验室开展实验前的准备工作。
(3)预备实验。综合实验按一人一组、独立研究的形式进行。由于学生在上综合实验课之前，只接受过基础实验的训练。在基础实验中，实验的准备工作及质量把关均由实验教师把控，学生做实验多以验证性体验为主。进入综合实验环节后，小型实验仪器的调试、试剂的配制、实验的操作要领等均由学生来把控。为保证实验教学质量，在教师讲解了仪器的操作要领、试剂的配制、实验操作规范及注意事项后，学生要经过大量的预试实验，反复比对实验数据。对于造成数据偏差大，或稳定性差的操作环节，组织讨论，分析疑点，找出原因，提出解决的方案，再反复修正操作、比对数据，直到每个操作细节准确无误，数据可靠、可信为止。
(4)数据的采集与处理。在实验过程中，依照预试的操作，尽量减少仪器、操作、人为随机等因素带来的偏差，样品的处理、测定方法保持一致。如用恒温水浴锅替代茶壶，可保证冲泡时温度稳定；又如冲泡所得的茶汤样品，为了避免放置时间长氧化，影响抗氧化活性测定结果，都是即时处理，并控制每个样显色、测定时间一致。每个样平行测定三次，取平均值计算。运用Excel软件对实验数据计算、绘图，找出实验结果的规律性。
(5)论文的撰写。撰写论文对于大三学生来说，有一定的难度。教师首先要拿一篇范文给学生讲解论文由哪几部分组成，每一部分有什么功能，如何写好每一部分，学生先模仿写作。经多次修改后，学生总算明白如何撰写文献综述，来说明自己做实验的意义；通过分析实验结果，来说明实验的创新点。其次要求学生严格修订文章的格式，重点包括文字、图、表的格式规范，参考文献标注及参考文献的书写格式，以及专业术语的表达等。
(6)学生成绩评定。由于综合实验涉及到多重环节的训练，学生的成绩重过程评价。具体成绩考核占比为：文献检索及实验方案的制定，占比为20%；实验设备、药品的准备，材料的采购及预处理，占比为10%；实验预试、实验过程、实验数据，占比为40%；论文撰写，占比为30%。
7 结语
本实验源于科研，服务于教学，符合新时期创新人才培养的教改需求。项目的创新点在于：(1)具有文化育人特色。项目以工夫茶文化为背景，让学生从茶文化出发提出问题，将冲泡工艺一个文化现象转化为一个化学问题，这不仅让学生得到良好的文化熏陶，而且利于培养学生在实践中善于发现问题和解决问题的能力，以及正确的科学思维习惯。(2)具有科教融合的特色。项目源于科研项目，转化为教学的校本课程，实验设计富含有趣味性，实验中文献的检索、方案的制订、实验操作、数据处理及论文撰写等一系列的实践过程，有利于培养学生的实践创新能力，养成良好的创新思维习惯与科学态度。(3)本实验充当了基础实验与专业实验的桥梁作用。学生通过本实验的学习，不仅巩固与拓宽了已学的知识及技能，而且了解了科学实践的过程及科学研究方法，为学生后续开展大学生“挑战杯”科技创新项目，独立完成毕业论文的工作打下了坚实的基础。总之，教学实践表明本实验具有良好的育人功能，且可操作性好，具有一定的推广价值。
参考文献
[1]
陈佳雯; 林秀玲; 孙彬妹; 刘少群; 郑鹏. 农业考古, 2021, (2), 33.
URL [本文引用: 1]
[5]
张祎敬; 宋贤良; 黄苇; 谢怡昕; 周颖君. 食品科技, 2018, 43 (1), 215.
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