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综述：体外人工制做消化道类器官的原理和应用

泰然健康网
2024-12-19 08:44

综述：体外人工制做消化道类器官的原理和应用 | Cell Regeneration

2020-08-12

论文标题：Generation of 3D human gastrointestinal organoids: principle and applications

期刊：Cell Regeneration

作者：Mengxian Zhang, Yuan Liu et.al

发表时间：2020/06/10

数字识别码：10.1186/s13619-020-00040-w

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消化道疾病诸如癌症、溃疡等能够影响人体正常的食物消化、营养吸收、免疫保护与激素分泌等功能，对人类健康构成巨大威胁。近十年来，基于干细胞体外3D培养技术制备的类器官（Organoids）由于其出色的自我更新和组织能力以及表现出一定的组织结构与功能引起越来越多的关注。早在1975年，就有人用单个皮肤细胞在体外培养成多层结构的克隆。但受限于对细胞外基质生物学和工艺学的充分认识，这个技术一直到2009年随着人工基质胶Matrigel 的使用才得以突破瓶颈。人们第一次用单个小鼠肠隐窝，通过加入各种因子在体外培养出了一个微型肠管。这个肠管具有了许多体内肠管才有的特性，甚至还有隐窝特有的芽结构。迄今为止，借助捐赠者的组织或细胞进行体外培养产生的胃肠类器官，不仅可以用来研究消化道形成的机制，还可以在体外建立消化道疾病模型以及药物筛选模型。清华大学的陈晔光教授团队特地撰文总结了胃肠道类器官的上皮稳态、制备方法以及应用前景，发表在Cell Regeneration上。

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胃肠上皮细胞的稳态调节

人的胃分为底部、体部和窦部。这些部位都包含一层内陷的腺体样上皮细胞。这层细胞可以分泌水、电解质、胃蛋白酶、胃酸以及一些激素比如胃泌素。将胃的三个部分从组织学上再进行细分的话，可以发现更多不同的结构和细胞类型（如图1A），其中峡区（isthmus，图中浅蓝色部分）存在一些未分化的胃干细胞，可以产生六种不同的细胞类型。胃上皮细胞稳态调节涉及到多个信号通路。Notch通路负责峡区细胞的增殖；FGF10抑制壁细胞（parietal cell）和主细胞（chief cell）分化；BMP通路能抑制炎症反应、抑制Lgr5阳性的干细胞活性、提高壁细胞的数量；Hedgehog通路中Sonic Hedgehog控制肩区（neck，图中棕色部分）壁细胞胃泌素分泌；India Hedgehog和Wnt通路则可促进窝区（pit，图中米色部分）上皮细胞增殖。

小肠上皮包含大量的隐窝和绒毛结构（如图1B）。在突出的绒毛结构中包括功能成熟的上皮细胞、杯状细胞、内分泌细胞和簇细胞等；而内陷的隐窝结构主要由许多未成熟的前体细胞、短暂增殖细胞（transient amplifying cell）、Lgr5阳性干细胞、潘氏细胞（Paneth cell）以及尚有争议的“+4”细胞等混合而成。小肠上皮是一类快速自我更新的组织，Lgr5阳性干细胞增殖分化产生短暂增殖细胞，随后短暂增殖细胞迁移到绒毛进一步分化形成成熟的各种细胞。与胃相似，Wnt、Notch、EGF、Hippo和BMP等通路在肠上皮细胞稳态中同样重要。

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胃肠道类器官3D培养

人胃肠道类器官能够通过原代上皮组织或干细胞培养获得。其基本流程如下：从患者身上获取的样品经HBSS缓冲液（Hank's平衡盐溶液）清洗后，剥离肌肉和结缔组织，将组织剪成小块，2mM EDTA冰上孵育30分钟后连续剧烈震荡，上皮细胞分离出来后，可以通过流式分选进一步得到单个干细胞。除了机械分离外，一些温和的中性蛋白酶或胶原酶也可用于组织消化。接下来将上皮细胞或干细胞种植在基质胶上。培养液3-5天更换，大约一周左右，就可以看到3D结构的类器官了，类器官可以传代也可以冻存，具备良好的显微外观和稳定的基因组。除此之外，气液界面培养系统也能够用来获得胃肠道类器官。将一个底部有渗透膜的内皿放在含有培养基的外皿中，上皮细胞包被在内皿上，培养基液面不能高于细胞以利于细胞与空气充分接触。大约几天时间，一个由极化单层上皮构成的3D球状物就会形成。

胃肠道类器官培养的另一种方法需要利用多能干细胞，多能干细胞包括胚胎干细胞与诱导多能干细胞，该方法走的是一条模拟体内发育的路线，需要经过内胚层诱导、组织特异球体形成、类器官特化等过程。这个方法需要通过不断地改变培养基和添加因子，缺点是周期长、步骤复杂且费用不菲，但更接近于体内发育过程，而且可以通过对培养前细胞进行基因编辑等手段，更好地用于胃肠器官形成的机制研究。

胃肠道类器官的成功培养需要合适的细胞外基质与培养基。Matrigel 是目前使用最广泛的细胞外基质，它来自于小鼠肉瘤，富含多种胶原蛋白、粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖等成分。类器官的培养基需要添加各种生长因子，前文中涉及到的各种信号通路对应的各种因子都会以不同的比例做成不同的培养基配方。同时，需要哪种类型的细胞，需要加强哪类细胞的功能，研究者们可以添加合适的因子，通过调整比例、培养时间、培养方式来达到研究需要。因此，类器官培养基的制备使用更像是一门工艺，所有人在材料和加工过程中都可以有自己独家秘方，通过不断地调整改进完善，让其渐臻完美。

胃肠道类器官应用前景

胃肠道类器官的应用前文中已有涉及，主要包括早期胚胎中消化道形成的分子机制研究；消化道疾病体外模型的建立；个性化治疗中的药物筛选；再生医学中胃肠道体外再生和器官移植等。

总的来说，胃肠道类器官具有前途光明，与其他组织工程相结合可以更好地模拟体内器官组织间复杂的相互调控关系。

摘要：The stomach and intestine are important organs for food digestion, nutrient absorption, immune protection and hormone production. Gastrointestinal diseases such as cancer and ulcer are big threats to human health. Appropriate disease models are in sore need for mechanistic understanding and drug discovery. Organoids are three-dimensional in vitro cultured structures derived from tissues and pluripotent stem cells with multiple types of cells and mimicking in vivo tissues in major aspects. They have a great potential in regenerative medicine and personalized medicine. Here, we review the major signaling pathways regulating gastrointestinal epithelial homeostasis, summarize different methods to generate human gastrointestinal organoids and highlight their applications in biological research and medical practice.

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