低聚半乳糖的酶法合成及其纯化研究
低聚半乳糖的酶法合成及其纯化研究
【摘要】： 低聚半乳糖是一类重要的益生元,是人体母乳的重要组成成分,不仅能促进人体肠道内双歧杆菌的增殖,还具有低龋齿性、促进矿物质吸收、改善脂质代谢等重要生理功能。本研究利用植物乳杆菌来源的β-半乳糖苷酶酶法合成低聚半乳糖,对其糖苷键结构进行鉴定,利用乳酸克鲁维酵母发酵法纯化低聚半乳糖,通过相关酶活及转录组学分析,探究了酵母细胞在低聚半乳糖溶液中的纯化机理,主要研究结果如下:1、筛选得到3株产高活力β-半乳糖苷酶的乳酸菌菌株,并通过测定β-半乳糖苷酶酶活及转糖基活性,确定使用植物乳杆菌Goqi的β-半乳糖苷酶用于制备低聚半乳糖。利用SDS-PAGE分离粗酶液中的蛋白质,并利用液质联用技术(LC-MS)进行蛋白鉴定,确定了植物乳杆菌Go qi的β-半乳糖苷酶分子量为35 kDa。2、优化了 β-半乳糖苷酶酶法合成低聚半乳糖的生产工艺,得到最适生产工艺为温度35℃,pH7.0,乳糖浓度400g/L,反应时间6h,采用此工艺生产的低聚半乳糖含量为30.54%。经气相色谱质谱联用仪(GC-MS)鉴定,表明所获得的低聚半乳糖包含8种低聚二糖和4种低聚三糖,主要结构式为:β-D-Galp-(1→6)-D-Lac、β-D-Galp-(1→3)-D-Lac 和 β-D-Galp-(1→6)-D-Glc。3、采用乳酸克鲁维酵母发酵法纯化低聚半乳糖,通过监测纯化过程中纯化液糖含量的变化,证明乳酸克鲁维酵母仅代谢乳糖、半乳糖和葡糖糖等杂糖组分,不会利用低聚半乳糖。分析相关酶活力和转录组学,证明了乳酸克鲁维酵母蛋白质等大分子合成受阻,但能够通过增加糖代谢过程及物质转运过程保证生长代谢,也证明了可以采用乳酸克鲁酵母进行纯化,获得高纯度的低聚半乳糖。乳酸克鲁维酵母纯化低聚半乳糖的优化工艺为可溶性固形物含量为10%、酵母添加量为75 g/L,纯化8 h后低聚半乳糖含量从30%提高到了 75%。综上,利用植物乳杆菌Goqi的β-半乳糖苷酶能够酶法合成低聚半乳糖,结合乳酸克鲁维酵母进行纯化,能够生产高纯度的低聚半乳糖。
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
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