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一种高活性乳糖酶突变体及其应用

泰然健康网
2024-12-24 19:49

一种高活性乳糖酶突变体及其应用

：本发明属于酶工程和食品工程，具体涉及一种乳糖酶酶分子的定向进化、定点突变及其催化应用。

背景技术

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背景技术：

1、低聚糖又称寡糖类，是指单糖分子通过糖苷键连接的、聚合度为2-10的直链或支链碳水化合物，可简单分为功能性低聚糖和普通低聚糖两大类。其中，功能性低聚糖(functional oligosaccharides)是指由2-10个相同或不同的单糖以糖苷键聚合而成，具有温和的甜味和感官特性，可作为脂肪和糖的部分代替物用于食品中并改善食品质地，但不被人体肠道酶消化，并到达大肠，作为生长因子促进双歧杆菌、乳杆菌等有益菌增殖，增强矿物质吸收，降低血脂、胆固醇和血糖指数，改善血压，对人体健康产生有益的影响。

2、低聚半乳糖(galactooligosaccharides，gos)是一种天然存在人乳、牛乳、羊乳中的功能性低聚糖，是一种重要的益生元，对人类健康发挥了重要作用。上世纪50年代，已有报道利用β-半乳糖苷酶催化乳糖生产低聚半乳糖的工业化技术相关研究，国际上gos产品于1988年成功上市。低聚半乳糖的生产，主要以乳糖为原料，利用乳糖酶的转糖基作用在乳糖水解过程中合成含一个葡萄糖或全部为半乳糖分子连接的低聚合度的寡糖，可表示为gal-(gal)n-glc/gal(n为1-4)。

3、乳糖酶(β-半乳糖苷酶的一种，ec 3.2.1.23)能够通过其转半乳糖基作用生成gos，是一种在乳品工业中非常具有商业价值的酶。用于生产gos的商品化乳糖酶一般来源于黑曲霉(a.niger)、米曲霉(a.oryzae)、乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维酵母(k.fragilis)、罗伦特隐球菌(cryptococcus laurentii)和环状芽胞杆菌(bacillus circulans)等菌株。不同来源的乳糖酶在酶活组成和转苷活性上有一定差别，同时gos的生产工艺不同，但催化合成的低聚半乳糖主要以β-1,3、β-1,4、β-1,6糖苷键连接，其中以β-1,4糖苷键为主。此外，针对酶的耐高温性能，研究开发出一些新型的耐高温乳糖酶。如嗜热硫矿硫化叶菌(sulfolobussolfataricus)、直杆糖多孢菌(saccharopolyspora rectivirgula)、激烈火球菌(pyrococcusfuriosus)和海栖热袍菌(thermotoga maritima)等微生物来源的乳糖酶，可以在70℃-80℃高温下催化合成gos。现有商品化乳糖酶，一般可以乳糖为原料形成5％-50％的低聚半乳糖。环状芽胞杆菌atcc31382生产出的乳糖酶(如)，是目前为止合成gos能力最强的乳糖酶，这个酶在酶制剂产品中有4中不同的存在形式(song j,abe k,imanaka h,imamura k,minoda m,yamaguchi s,and nakanishi k,biosci.biotechnol.biochem.,2011；75,268-278)，其中，β-gal-c和β-gal-d被认为是最有价值用于gos的生产。从环状芽胞杆菌b2301中鉴定出的乳糖酶，具有在60℃以上的高温条件下催化乳糖形成54.5％的gos，是目前所有报道的乳糖酶中gos合成性能最好的乳糖酶(赵继华等，食品与发酵工业，2020)；高产乳糖酶的重组菌株-地衣芽胞杆菌bcbtbc168d发酵制备乳糖酶bcbg168-d的表达水平显著提高(中国发明专利，zl202011051056.1)，实现了低聚半乳糖生产专用酶的高效制备。

4、在应用于工业化制备低聚半乳糖的过程中也发现，环状芽胞杆菌乳糖酶催化乳糖中的半乳糖基转糖基体系中，反应终了仍然会出现高比例的底物乳糖的残留，通常残留在25％-30％，明显增大了低聚半乳糖特别是高纯度低聚半乳糖的制备成本。此外，进一步提高其催化活性，也将会明显降低其应用过程的用酶成本并有可能进一步降低低聚半乳糖的制造成本。因此本技术通过对乳糖酶的3d结构分析和底物/产物分子对接，获得乳糖酶分子中有可能提高酶活的可能突变位点，再通过定点突变并进行异源表达制备突变体，检测其酶活及其催化产物形成特征，获得了一种催化活力显著提升的高活性乳糖酶，可应用于高效催化乳糖为低聚半乳糖，并有利于降低乳糖酶的制备成本。

技术实现思路

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技术实现要素：

1、本发明的目的是通过定向分子进化获得相应的乳糖酶突变体，提高其催化乳糖合成低聚半乳糖的活性并显著降低反应体系中底物乳糖的剩余量，由此可显著改善乳糖酶的应用性能并扩展其应用领域，提升乳糖酶工业规模下制造效率。

2、为了实现上述目的，本发明以乳糖酶bcbg168-d编码基因(序列表seq id no.1所示核苷酸序列)或其氨基酸序列(序列表seq id no.2所示)为基础，分析可能发生突变的氨基酸残基(其中所描述的乳糖酶突变位点选择是根据原始乳糖酶分子bcbg168-d(序列表seq id no.2)与葡萄糖分子对接并分析结果获得)，通过定点突变制备突变体，通过突变体的表达与定向筛选，获得性能优良的乳糖酶突变体，分析评价其酶促应用性能，并评价其在低聚半乳糖制备中的应用价值。

3、本发明提供的技术方案之一，是一种乳糖酶突变体，所述乳糖酶突变体是在seqid no.2所示原始乳糖酶的基础上发生氨基酸序列中的氨基酸残基t446单点突变获得的；

4、进一步，所述乳糖酶突变体是在seq id no.2所示的氨基酸残基t446上的突变，可以是被其余19种氨基酸残基任意替换，即：苏氨酸残基可以用丙氨酸(ala，a)【此突变记为：t446→t446a，以此类推】、精氨酸(arg，r)、天冬氨酸(asp，d)、半胱氨酸(cys，c)、谷氨酰胺(gln，q)、谷氨酸(glu，e)、组氨酸(his，h)、异亮氨酸(ile，i)、甘氨酸(gly，g)、天冬酰胺(asn，n)、亮氨酸(leu，l)、赖氨酸(lys，k)、蛋氨酸(met，m)、苯丙氨酸(phe，f)、脯氨酸(pro，p)、丝氨酸(ser，s)、色氨酸(trp，w)、酪氨酸(tyr，y)或缬氨酸(val，v)替换；

5、优选地，所述乳糖酶突变体是在seq id no.2所示原始乳糖酶的基础上发生t446v、t446f、t446k、t446m、t446n、t446c、t446w突变中的任意一种获得的；

6、更优选地，所述乳糖酶突变体是在seq id no.2所示原始乳糖酶的基础上发生t446v或t446n获得的；

7、进一步地，所述乳糖酶突变体为氨基酸序列如seq id no.4所示的t446v。

8、本发明提供的技术方案之二，是上述乳糖酶突变体的编码基因。

9、本发明提供的技术方案之三，是包含上述编码基因的重组载体或重组菌株；

10、进一步地，所述重组载体采用的表达载体为phy-wzx质粒；

11、进一步地，所述重组菌株采用的宿主为地衣芽胞杆菌bcbt0529(已公布在中国发明专利zl202011051056.1中)；

12、更进一步地，所述重组菌株是将所述乳糖酶突变体编码基因克隆入表达载体phy-wzx，在地衣芽胞杆菌bcbt0529宿主细胞中进行重组表达获得。

13、本发明提供的技术方案之四，是上述重组载体或重组菌株的应用，特别是在生产技术方案一所述乳糖酶突变体中的应用。

14、本发明提供的技术方案之五，是技术方案一所述乳糖酶突变体的应用，特别是在生产低聚半乳糖中的应用。

15、有益效果：

16、本发明中的乳糖酶突变体，为通过定向分子进化获得的、具有催化乳糖生成低聚半乳糖的高活性乳糖酶突变体，其中t446v突变体比酶活提高71.1％，并且反应体系中，底物乳糖的残余量显著降低，减低了5.54％。本发明乳糖酶新分子具有更好的应用于低聚半乳糖制备的效率、提高产品质量并同步降低生产成本，连带有助于提高新表达菌种的产酶水平和进一步降低乳糖酶发酵制备的成本。