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一种转糖基β－半乳糖苷酶产生菌的制作方法

泰然健康网
2024-12-24 19:51

专利名称：一种转糖基β－半乳糖苷酶产生菌的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种肠杆菌，尤其涉及一种可以产生转糖基β-半乳糖苷酶的阴沟肠杆菌。
背景技术：
低聚半乳糖是母乳中的天然组分之一，其最重要最根本的生理功能源于它对双歧杆菌的增殖作用。由于低聚半乳糖具有很好的热稳定性和耐酸性，其保健作用引起了人们的极大关注。目前，低聚半乳糖的生产主要通过微生物酶法合成，即通过β-半乳糖苷酶或乳糖酶以乳糖为底物转糖基合成。我国低聚半乳糖的开发研究还处于起始阶段，自主的微生物酶法工业生产尚属空白，乳品工业中使用的乳糖酶全部依赖进口。因此，寻求可以产生较强转糖基活性β-半乳糖苷酶的微生物，对于填补国内自主的微生物酶法生产低聚半乳糖的空白有着重要意义。
经检索，目前国际上没有阴沟肠杆菌β-半乳糖苷酶以乳糖为底物催化生产低聚半乳糖的报道。

发明内容
针对现有微生物酶法工业生产中，转糖基β-半乳糖苷酶的微生物种类有限，特别是能够产生较强转糖基活性β-半乳糖苷酶的微生物的不足，本发明的目的是提供一株新分离的可产生较强转糖基活性β-半乳糖苷酶的阴沟肠杆菌，此菌产生的β-半乳糖苷酶以乳糖为底物可以催化生产低聚半乳糖。
本发明提供的可产生较强转糖基活性β-半乳糖苷酶的菌株，名为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5，已于2005年6月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.1401。
本发明涉及的转糖基β-半乳糖苷酶产生菌——阴沟肠杆菌是从土壤中分离获得。土壤样品微生物经乳糖富集选择培养后通过两次活性筛选得到，即先以乳糖为唯一碳源将样品微生物富集培养后进行平板选择分离，然后再筛选β-半乳糖苷酶水解活性和转半乳糖基活性而得到。
本发明涉及的可产生较强转糖基活性β-半乳糖苷酶的阴沟肠杆菌，具有如下生物学特征形态学特征是革兰氏阴性杆菌；在LB培养基上，菌体形态随培养时间的延长发生变化，从长杆状到短杆状、椭球形、最后缩至球形，染色的大小为0.5-1.5×0.7-9.0微米；单个、成对或短链状排列；以周生鞭毛运动；不形成芽孢。
生理生化特征是能利用柠檬酸盐或醋酸盐为唯一碳源；37℃发酵葡萄糖产酸产气；甘油发酵不产气；不水解七叶灵；不产生吲哚；V.P.测定阳性；甲基红测定阴性；还原硝酸盐；赖氨酸不脱羧，有鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、脲酶；其它特征详见表1。
表1阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5 CGMCC No.1401生理生化特征

注+.阳性；-.阴性本发明涉及的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5CGMCC No.1401在乳糖斜面培养基中传代稳定；在LB液体培养基中生长良好；在产酶发酵培养基中生长良好，并且产生转糖基β-半乳糖苷酶；培养温度为35～40℃；培养时间为15～24小时，摇床转速为180转/分。
上述LB培养基配方蛋白胨10±1g/L，酵母粉5±1g/L，氯化钠7±1g/L，pH7.0～7.5，121℃灭菌20分钟；筛选上述阴沟肠杆菌所用的选择培养基或斜面培养基配方是乳糖10±2g/L，蛋白胨5±2g/L，酵母粉10±2g/L，氯化钠3±2g/L，pH7.0～7.5，固体培养基加琼脂20±2g/L；112℃灭菌30分钟。
上述产酶发酵培养基配方是乳糖10±2g/L，蛋白胨5±2g/L，酵母粉10±2g/L，氯化钠3±2g/L，pH7.0～7.5，112℃灭菌30分钟。
其中，上述培养温度优选为37℃。
其中，上述培养时间优选为16～18小时。
其中，筛选上述阴沟肠杆菌所用的选择培养基或斜面培养基配方优选是乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，氯化钠3g/L，pH 7.5，固体培养基加琼脂20g/L。
其中，上述产酶发酵培养基配方优选是乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，氯化钠3ga，pH7.5。
本发明涉及的菌株阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5CGMCC No.1401的16SrDNA核苷酸序列长度为1534碱基，如序列表中SEQ ID No.1所示。
通过在美国生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的网上分析，将本发明菌株阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5的16S rDNA序列与GenBank中已登录的16S rDNA序列进行同源性比较，结果表明，菌株B5的16SrDNA基因序列与肠杆菌属几株菌的16S rDNA序列相似性很高，但却不完全相同，说明本发明的菌株是首次分离鉴定。结合菌株B5形态学及生理生化特征，根据伯杰细菌鉴定手册(第九版)，将本发明菌株B5菌鉴定为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)。并于2005年6月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.1401。
本发明提供的转糖基β-半乳糖苷酶产生菌在制备转糖基β-半乳糖苷酶的生产中的应用本发明的转糖基β-半乳糖苷酶产生菌可以在产酶发酵培养液中培养产生转糖基β-半乳糖苷酶，在生产低聚半乳糖的过程中，经产酶发酵培养液培养获得菌细胞，经冻融后，即为β-半乳糖苷酶粗酶液。
本发明提供的转糖基β-半乳糖苷酶产生菌在制备低聚半乳糖的生产中的应用在制备低聚半乳糖的生产中，本发明是先将阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5CGMCCNo 1401经产酶发酵培养液培养后，制成β-半乳糖苷酶粗酶液，所述β-半乳糖苷酶以乳糖为底物催化生产低聚半乳糖。
经检索，目前国内外没有阴沟肠杆菌β-半乳糖苷酶以乳糖为底物催化生产低聚半乳糖的报道。而利用本发明菌株阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5CGMCC No.1401进行的试验表明本发明的菌株涉及的阴沟肠杆菌β-半乳糖苷酶能以乳糖为底物反应生成低聚半乳糖，并且得率较高，约为54.5％。该菌生长快，培养简单，遗传性质稳定，转糖基效率高，具有很强的工业化生产优势，可用于工业生产低聚半乳糖，以填补国内自主的微生物酶法生产低聚半乳糖的空白。
具体实施例方式
实施例1菌种筛选1.能利用乳糖为唯一碳源生长菌株的分离纯化将10g土样加入100mL以乳糖为唯一碳源的培养液中富集培养，将培养液用无菌水稀释成10-1、10-3、10-5、10-7梯度，各取200μL均匀涂布于乳糖选择平板上。细菌筛选平板于37℃培养24小时，真菌筛选平板于28℃培养48～60小时。10-5梯度平板长出的菌落种类多，并且便于纯化。分别挑取形态不同的菌落，通过平板划线进行分离纯化，重复3次。对分离菌株进行镜检，确定纯度细菌以金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)和大肠杆菌(Escherichia coli)作对照，进行革兰氏染色，镜检可区分革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌；真菌制成水浸片，镜检可观察菌丝特征及孢子产生方式，初步鉴定到属。最后将镜检得到的纯化菌株分别保存到试管斜面上，4℃储藏。
上述分离纯化过程共获得15株菌能以乳糖为唯一碳源生长，其中细菌9株、真菌6株。将15株菌分别进行编号，细菌为B1、……、B9；真菌为F1、……、F6。
上述细菌筛选用细菌富集选择培养基(也作为斜面培养基)，其配方是乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，氯化钠3g/L，pH7.0～7.5，固体培养基加琼脂20g/L。
上述真菌筛选用真菌富集选择培养基(也作为斜面培养基)，其配方是土豆汁(土豆200g/L)，乳糖10g/L，琼脂20g/L，自然pH。
2.产β-半乳糖苷酶菌株的筛选将上述分离得到的15株菌分别接种至30mL产酶发酵培养液中，细菌于37℃摇床培养18小时，真菌于28℃摇床培养40小时，摇床转速均为180转/分。细菌和酵母培养液于12,000转/分离心5分钟获得菌细胞；霉菌用滤纸(双圈牌101快速定性滤纸)抽滤获得菌细胞。然后测定菌细胞β-半乳糖苷酶水解活性将菌细胞与β-半乳糖苷酶水解底物——邻硝基苯酚-β-D-半乳糖苷(o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，ONPG)混合进行反应，如果ONPG被水解，即认为该菌产β-半乳糖苷酶。
取菌细胞50mg，加2mmol/L的ONPG(无色)溶液450μL，40℃反应10分钟，加1mL0.5mol/L的Na2C03溶液终止反应，12,000转/分离心2分钟。如果上清液呈黄色，说明原无色的ONPG被β-半乳糖苷酶水解成了黄色的邻硝基苯酚，菌细胞有β-半乳糖苷酶的存在。如果对上清液测OD400，可以对水解酶活定量。酶的活力单位规定以1分钟水解ONPG释放1μmol邻硝基苯酚的酶量为一个酶活力单位。
上述筛选过程共获得9株β-半乳糖苷酶产生菌，其中5株细菌、4株真菌，分别为B1、B2、B4、B5、B9、F1、F2、F3、F4。
上述产酶发酵培养基配方是乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，CaCl20.11g/L，MnSO40.001g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，KH2PO40.05g/L，FeSO4·7H2O 0.03g/L，pH 7.0～7.5(细菌)或pH 6.0～6.5(真菌)。
3.产转糖基β-半乳糖苷酶菌株的筛选将上述9种β-半乳糖苷酶产生菌的菌细胞制成粗酶液，进行转半乳糖基活性的筛选。
取50mg菌细胞，悬浮于50μL pH7.0、50mmol/L的磷酸钾缓冲液中，于-20℃以下温度完全冷冻后，置室温解冻，再重复冻融2次，所得悬液即为β-半乳糖苷酶粗酶液。取100μL粗酶液，加入300μL pH7.0磷酸钾缓冲液配制的30％(w/v)乳糖溶液，分成2等份分别于40℃、50℃进行反应，细菌反应4小时，真菌反应8小时，12,000转/分离心5分钟，上清液即含反应产物——低聚半乳糖。
将反应产物进行薄层层析(Thin-Layer Chromatography，TLC)分析，确定转糖基活性。TLC薄板(Silica ge160，No.553，Merck)点样后，在展层剂(正丁醇∶乙醇∶水＝5∶3∶2)中展层，雾喷显色剂(20％硫酸溶液+0.5％的3，5-二羟基甲苯)，于120℃烘烤10分钟，糖斑点的显色根据其种类从棕黄色至深紫色。如果乳糖斑点附近生成了新的寡糖斑点，则产生的β-半乳糖苷酶有转糖基活性；反之则不存在转糖基活性。寡糖斑点越大、越多，说明酶的转糖基活性越强。
结果确定2株细菌(B1、B5)和1株真菌(F3)具有较好的转糖基活性。
将菌株B1、B5和F3的转糖基产物进行高效液相色谱(High Performance LiquidChromatography，HPLC)分析和薄层扫描分析，结果B5的低聚糖得率最高，约为54.5％。
B5菌由16S rDNA同源序列比较和生理生化特性鉴定为阴沟肠杆菌，菌种鉴定详见实施例2。经检索，目前国际上没有本发明所涉及的阴沟肠杆菌β-半乳糖苷酶以乳糖为底物催化生产低聚半乳糖的报道。
上述HPLC分析所用设备及条件岛津(SHIMADZU)高效液相色谱仪；岛津RID-10A示差检测器；BIO-RAD Aminex HPX-42C柱(300mm×7.8mm)；流动相为三蒸水，流速为0.2mL/min，柱温80℃；结果分析软件为Class-VP6.0。转糖基产物用0.2μm滤膜过滤后，稀释成5％(w/v)的糖溶液，进样分析。
上述薄层扫描分析所用设备及条件岛津(SHIMADZU)CS-9301双波长飞点薄层扫描仪，检测波长为550nm。对上述薄层层析板进行扫描分析。
实施例2菌种鉴定1.形态学及生理生化特征本发明分离筛选出的菌株阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5CGMCC No.1401，形态学特征是革兰氏阴性杆菌；在LB培养基上，菌体形态随培养时间的延长发生变化，从长杆状到短杆状、椭球形、最后缩至球形，染色的大小为0.5-1.5×0.7-9.0微米；单个、成对或短链状排列；以周生鞭毛运动；不形成芽孢；生理生化特征是能利用柠檬酸盐或醋酸盐为唯一碳源；37℃发酵葡萄糖产酸产气；甘油发酵不产气；不水解七叶灵；不产生吲哚；V.P.测定阳性；甲基红测定阴性；还原硝酸盐；赖氨酸不脱羧，有鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、脲酶；其它特征详见表1。
2.16S rDNA PCR扩增及同源性分析将本发明分离筛选出的阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5 CGMCC No.1401，接种于5mLLB培养基中，37℃摇床培养16小时，取1.5ml培养物，12,000转/分离心2分钟，所得沉淀悬于565μL的TE缓冲液中；加入30μL质量体积比为10％的十二烷基磺酸钠(SDS)和5μL20mg/mL的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1小时；加入100μL5mol/LNaCl充分混匀，再加入80μL CTAB/NaCl溶液，混匀，于65℃温育20分钟；然后冰浴30分钟；加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀；12,000转/分离心5分钟，将上清液转入一个新管中，再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀；12,000转/分离心5分钟，将上清转入一支新管中，加入2倍体积无水乙醇，轻轻混匀直到DNA沉淀下来；12,000转/分离心5分钟，DNA沉淀用70％乙醇中洗涤2次；真空干燥10分钟，重溶于50μL的TE缓冲液。
TE缓冲液配方如下10mmol/L的三羟甲基氨基甲烷(Tris)，1mmol/L的乙二胺四乙酸二钠(EDTA)，调pH为8.0。
CTAB/NaCl溶液配方如下10％(w/v)的十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)溶解于0.7mol/L的NaCl中。
以提取的阴沟肠杆菌基因组DNA为模板，采用细菌16S rDNA序列通用引物F27(5’-AGAGTTTCMTGGCTCAG-3’)和R1541(5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)，进行PCR扩增。PCR扩增体系总体积为50μL，含超纯水35μL，10×PCR buffer 5μL，dNTP2.4mmol/L，引物各1μmol/L，MgCl21.5mmol/L，模板DNA100ng，Taq酶2.5U。PCR扩增条件95℃预变性5分钟；反应28个循环(95℃变性1分钟，52℃退火1分钟，72℃延伸2分钟)；28个循环结束后72℃延伸10分钟。PCR产物约为1.5kb左右，经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外分析仪检测，然后回收，连接到质粒pUCm-T载体上，转化E.coli Top10感受态细胞，涂布氨苄青霉素平板，提取质粒DNA检测，Pst I酶切验证。将带有16S rDNA的正确质粒进行测序。
阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5CGMCC No.1401菌株16S rDNA序列长度为1534碱基，核苷酸序列如下agagtttgat catggctcag attgaacgct ggcggcaggc ctaacacatg caagtcgaac60ggtagcacag agagcttgct ctcgggtgac gagtggcgga cgggtgagta atgtctggga120aactgcctga tggaggggga taactactgg aagcggtagc taataccgca taacgtcgca180agaccaaaga gggggacctt cgggcctctt gccatcagat gtgcccagat gggattagct240agtaggtggg gtaacggctc acctaggcga cgatccctag ctggtctgag aggatgacca300gccacactgg aactgagaca cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg360cacaatgggc gcaagcctga tgcagccatg ccgcgtgtat gaagaaggcc ttcgggttgt420aaagtacttt cagcggggag gaaggtgttg aggttaataa cctcagcaat tgacgttacc480cgcagaagaa gcaccggcta actccgtgcc agcagccgcg gtaatacgga agggtgcaag540cgttaatcgg aattactggg gcgtaaagcg cacgcaggcg gtctgtcaag tcggatgtga600aatccccggg ctcaacctgg gaactgcatt cgaaactggc aggctagagt cttgtagagg660ggggtagaat tccaggtgta gcggtgaaat gcgtagagat ctggaggaat accggtggcg720aaggcggccc cctggacaaa gactgacgct caggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga780ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac gatgtcgact tggaggttgt gcccttgagg840cgtggcttcc ggagctaacg cgttaagtcg accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa900
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实施例3利用阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5CGMCC No.1401生产低聚半乳糖1.菌种培养选择本发明分离筛选出的菌株阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5CGMCCNo.1401，以常规方法活化、再转接入产酶发酵培养液培养。
上述产酶发酵培养基配方是乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，CaCl20.11g/L，MnSO40.001g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，KH2PO40.05g/L，FeSO4·7H2O 0.03g/L，pH7.0～7.5(细菌)或pH6.0～6.5(真菌)。
经过系列实验摸索优化产酶发酵培养液，最终阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5 CGMCC No.1401的产酶发酵培养基配方简化为乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，氯化钠3g/L，pH7.5。
将阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5 CGMCC No.1401接种至新鲜斜面培养基活化后，接一环到50mL上述产酶发酵培养液，于37℃摇床培养16小时，摇床转速为180转/分，或培养后再转接入500mL相同产酶发酵培养液扩大培养，阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5 CGMCC No.1401在上述培养基中生长产酶良好；培养结束后，12,000转/分离心5分钟，收获阴沟肠杆菌细胞。
稳定性实验表明，该菌株具有非常高的稳定性，数代后产酶能力没有降低。
上述斜面培养基配方为乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，氯化钠3g/L，琼脂20g/L，pH7.5。
2.转糖基反应取上述50mg制备的阴沟肠杆菌细胞，加250μL、pH 7.0的50mmol/L磷酸钾缓冲液洗涤一次，阴沟肠杆菌细胞再重悬浮于50μL相同的缓冲液，-20℃以下完全冷冻后，置室温解冻，再重复冻融2次，所得悬液即为β-半乳糖苷酶粗酶液。
取100μL上述粗酶液，加入300μL、pH 7.0磷酸钾缓冲液配制的30％(w/v)乳糖溶液，于50℃水浴摇床反应4小时，12,000转/分离心5分钟，上清即为转糖基产物。
对上述转糖基产物进行高效液相色谱分析和薄层扫描分析，低聚半乳糖得率约为54.5％。
上述HPLC分析所用设备及条件岛津(SHIMADZU)高效液相色谱仪；岛津RID-10A示差检测器；BIO-RAD Aminex HPX-42C柱(300mm×7.8mm)；流动相为三蒸水，流速为0.2mL/min，柱温80℃；结果分析软件为Class-VP6.0。转糖基产物用0.2μm滤膜过滤后，稀释成5％(w/v)的糖溶液，进样分析。
上述薄层扫描分析所用设备及条件岛津(SHIMADZU)CS-9301双波长飞点薄层扫描仪；检测波长为550nm。取0.5uL转糖基产物在TLC薄板上点样后，在展层剂(正丁醇∶乙醇∶水＝5∶3∶2)中展开，雾喷显色剂(20％硫酸溶液+0.5％的3，5-二羟基甲苯)，于120℃烘烤10分钟，糖斑点显色后，进行扫描分析。
序列表SEQ ID No.1<110>山东大学<120>一种转糖基β-半乳糖苷酶产生菌<141>2005-6-16<211>1534<212>DNA<213>阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)<221>阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5 CGMCC No.1401 16S rDNA<222>(1)…(1534)<400>
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1.一株转糖基β-半乳糖苷酶产生菌，其特征在于该菌名为阴沟肠杆菌(Enterobactercloacae)B5，已于2005年6月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.1401。
2.如权利要求1所述转糖基β-半乳糖苷酶产生菌，具有如下生物学特征形态学特征是革兰氏阴性杆菌；在LB培养基上，菌体形态随培养时间的延长发生变化，从长杆状到短杆状、椭球形、最后缩至球形，染色的大小为0.5-1.5×0.7-9.0微米；单个、成对或短链状排列；以周生鞭毛运动；不形成芽孢；生理生化特征是能利用柠檬酸盐或醋酸盐为唯一碳源；37℃发酵葡萄糖产酸产气；甘油发酵不产气；不水解七叶灵；不产生吲哚；V.P.测定阳性；甲基红测定阴性；还原硝酸盐；赖氨酸不脱羧，有鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、脲酶；该菌的16S rDNA核苷酸序列长度为1534碱基，具有如SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。
3.如权利要求1或2所述转糖基β-半乳糖苷酶产生菌，其特征是，所述阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5 CGMCC No.1401在乳糖斜面培养基中传代稳定；在LB液体培养基中生长良好；在产酶发酵培养基中生长良好，并且产生转糖基β-半乳糖苷酶；培养温度为35～40℃；培养时间为15～24小时，摇床转速为180转/分；上述LB培养基配方蛋白胨10±1g/L，酵母粉5±1g/L，氯化钠7±1g/L，pH7.0～7 5，121℃灭菌20分钟；筛选上述阴沟肠杆菌所用的选择培养基或斜面培养基配方是乳糖10±2g/L，蛋白胨5±2g/L，酵母粉10±2g/L，氯化钠3±2g/L，pH7.0～7.5，固体培养基加琼脂20±2g/L，112℃灭菌30分钟；上述产酶发酵培养基配方是乳糖10±2g/L，蛋白胨5±2g/L，酵母粉10±2g/L，氯化钠3±2g/L，pH7.0～7.5，112℃灭菌30分钟。
4.如权利要求3所述的转糖基β-半乳糖苷酶产生菌，其特征是，所述培养温度为37℃。
5.如权利要求3所述的转糖基β-半乳糖苷酶产生菌，其特征是，所述培养时间为16～18小时。
6.如权利要求3所述的转糖基β-半乳糖苷酶产生菌，其特征是，所述阴沟肠杆菌的选择培养基或斜面培养基配方是乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，氯化钠3g/L，pH7.5，固体培养基加琼脂20g/L。
7.如权利要求3所述的转糖基β-半乳糖苷酶产生菌，其特征是，所述产酶发酵培养基配方是乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，氯化钠3g/L，pH7.5。
8.权利要求1或2所述的转糖基β-半乳糖苷酶产生菌在制备转糖基β-半乳糖苷酶的生产中的应用。
9.权利要求1或2所述的转糖基β-半乳糖苷酶产生菌在制备低聚半乳糖的生产中的应用。
10.如权利要求9所述的转糖基β-半乳糖苷酶产生菌在制备低聚半乳糖的生产中的应用，其特征是，所述阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5 CGMCC No.1401产生的转糖基β-半乳糖苷酶以乳糖为底物催化生产低聚半乳糖。
全文摘要
本发明公开了一株转糖基β－半乳糖苷酶产生菌，该菌名为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5，保藏编号为CGMCC No.1401。该菌为革兰氏阴性杆菌；在LB培养基上，菌体形态随培养时间的延长发生变化，从长杆状到短杆状、椭球形、最后缩至球形，染色的大小为0.5－1.5×0.7－9.0微米；单个、成对或短链状排列；以周生鞭毛运动；不形成芽孢；能利用柠檬酸盐或醋酸盐为唯一碳源；37℃发酵葡萄糖产酸产气；甘油发酵不产气；不水解七叶灵；不产生吲哚；V.P.测定阳性；甲基红测定阴性；还原硝酸盐；赖氨酸不脱羧，有鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶、脲酶；该菌的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。该菌产生的β－半乳糖苷酶能以乳糖为底物催化生产低聚半乳糖。
文档编号C12P19/00GK1837355SQ20051004409
公开日2006年9月27日申请日期2005年7月21日优先权日2005年7月21日
发明者肖敏, 卢丽丽申请人:山东大学