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慢性胰腺炎的尿液蛋白标志物及其用途的制作方法

泰然健康网
2024-12-28 21:06

本申请涉及临床医学，具体涉及人慢性胰腺炎相关的蛋白标志物。具体而言，本申请涉及利用大鼠慢性胰腺炎疾病模型和质谱分析获得的人慢性胰腺炎疾病诊断、病情监测相关的蛋白标志物的用途。

背景技术：

生物标志物是与生理或病理性过程相关的可监测的变化。疾病标志物的研宄一直是近年的研究热点和难点。合适的标志物意味着能够更早、更灵敏的提示疾病发生发展情况，并为疾病的诊疗、预后提供准确的信息，从而更有利于病人的健康。

生物标志物的本质是变化，尿液作为机体经由泌尿系统及尿路排出体外的排泄物，富集全身的变化，敏感，不受稳态机制的调控。因此其变化早，可以反映各种疾病早期的变化。这些变化就是潜在的疾病标志物(参见youheg.canurinebethegoldmineforbiomarkerdiscovery？scichinalifesci2013；43)。尿蛋白质组学作为一种新颖，无创的分析工具，可以在尿液里挖掘疾病特异的早期生物标志物，目前尿蛋白组分析深度可鉴定到6000多个蛋白(zhao,m等人acomprehensiveurinaryproteomeanalysis:potentialapplicationsindiseasebiomarkerdiscoveryandvalidation.thelancet,2015.386:p.s63)。在疾病标志物的研究中具有重大的临床应用前景。

慢性胰腺炎(chronicpancreatitis，cp)是由各种病因引起胰腺组织和功能不可逆改变的慢性炎症性疾病。其临床表现主要为腹痛，病理表现主要为胰腺实质慢性炎症损害和间质纤维化(tetsuhideito等人，evidence-basedclinicalpracticeguidelinesforchronicpancreatitis.2015[j].jgastroenterol，2016)。

近年来发病率逐年增加，病因复杂，病情迁延，严重影响患者的生活质量。目前临床上对该疾病的诊断尤其是早期诊断仍然面临很多挑战。慢性胰腺炎的诊断方法主要有影像学检查，胰腺功能检查和胰腺活检。影像学的信息不能在疾病更早期提供有价值的诊断线索，胰腺功能检查敏感度低，以及胰腺活检是cp诊断的确定性标准，但活检本身存在一定的缺陷。因此，亟需开发无创的生物标志物。

技术实现要素：

鉴于本领域的上述需求，根据本公开的一些实施方案，提供了蛋白的鉴定试剂在制备用于诊断慢性胰腺炎的试剂中的用途，其中所述鉴定试剂特异于选自以下任一项或其组合：

cd48抗原、igγ-1链c区、l-乳酸脱氢酶b链、na(+)/h(+)交换调节因子nhe-rf3、thy-1膜糖蛋白、t-激肽原2、v型质子atp酶亚单位s1、α2-巯基糖蛋白、α-2-巯基糖蛋白、β-2-微球蛋白、氨基酰化酶-1a、白介素-4受体α亚单位、半胱氨酸蛋白酶抑制剂-b、巢蛋白-2、淀粉样βa4蛋白、多聚免疫球蛋白受体、二肽基肽酶2、分拣蛋白、分泌型焦磷酸蛋白24、钙粘蛋白-2、谷氨酰胺基肽酶、谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位(gclc)、核连蛋白-2、黄曲霉素b1醛还原酶3、肌动蛋白胞质1、基质-重构-相关蛋白8、甲基多巴aβ亚基、胶原c-肽链内切酶增强子1、聚糖蛋白-3、聚糖核心蛋白、醌氧化还原酶、磷蛋白质分泌24、磷酸甘油酸酯变位酶1、磷酸赖氨酸磷酸组氨酸亚磷酸无机焦磷酸磷酸酶、硫酸软骨素蛋白多糖4、氯胞内通道蛋白1、钠依赖的中性氨基酸载体b(0)at3、内皮细胞选择性粘附分子、凝血素、前列腺腺激肽释放酶-6、线粒体犬尿氨酸/α氨基乙二酸转氨酶、软骨低聚物基质蛋白、神经细胞黏附分子1、生长抑制蛋白6、双糖链蛋白多糖、碳酸酐酶1、唾液酸o-乙酰酯酶、纤连蛋白、血清淀粉样p物质、乙醇脱氢酶(辅酶ⅱ(+))、中性和碱性氨基酸运输蛋白质rbat、组织α-左旋岩藻糖苷酶。

在具体的实施方案中，和健康对照相比较，选自以下蛋白的表达水平降低指示所述受试者患有慢性胰腺炎：cd48抗原、l-乳酸脱氢酶b链、na(+)/h(+)交换调节因子nhe-rf3、thy-1膜糖蛋白、v型质子atp酶亚单位s1、α-2-巯基糖蛋白、氨基酰化酶-1a、白介素-4受体α亚单位、半胱氨酸蛋白酶抑制剂-b、巢蛋白-2、淀粉样βa4蛋白、二肽基肽酶2、分拣蛋白、分泌型焦磷酸蛋白24、钙粘蛋白-2、谷氨酰胺基肽酶、谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位、黄曲霉素b1醛还原酶3、肌动蛋白胞质1、基质-重构-相关蛋白8、甲基多巴aβ亚基、胶原c-肽链内切酶增强子1、聚糖蛋白-3、聚糖核心蛋白、醌氧化还原酶、磷蛋白质分泌24、磷酸甘油酸酯变位酶1、磷酸赖氨酸磷酸组氨酸亚磷酸无机焦磷酸磷酸酶、硫酸软骨素蛋白多糖4、氯胞内通道蛋白1、钠依赖的中性氨基酸载体b(0)at3、内皮细胞选择性粘附分子、凝血素、线粒体犬尿氨酸/α氨基乙二酸转氨酶、软骨低聚物基质蛋白、神经细胞黏附分子1、生长抑制蛋白6、双糖链蛋白多糖、唾液酸o-乙酰酯酶、纤连蛋白、血清淀粉样p物质、乙醇脱氢酶(辅酶ⅱ(+))、中性和碱性氨基酸运输蛋白质rbat、组织α-左旋岩藻糖苷酶、及其组合。

在具体的实施方案中，和健康对照相比较，选自以下蛋白的表达水平提高指示所述受试者患有慢性胰腺炎：igγ-1链c区、t-激肽原2、β-2-微球蛋白、多聚免疫球蛋白受体、核连蛋白-2、前列腺腺激肽释放酶-6、碳酸酐酶1及其组合。

在具体的实施方案中，健康对照是指未患有慢性胰腺炎的个体。

在另一个实施方案中，提供了选自以下的蛋白的鉴定试剂在制备用于受试者的慢性胰腺炎早期诊断的试剂中的用途，其中所述鉴定试剂特异于选自以下任一项或其组合：igγ-1链c区、核连蛋白-2、β-2-微球蛋白、白介素-4受体α亚单位、磷酸甘油酸酯变位酶1、二肽基肽酶2、分泌型焦磷酸蛋白24、聚糖核心蛋白、内皮细胞选择性粘附分子、巢蛋白-2、血清淀粉样p物质、神经细胞黏附分子1、磷酸赖氨酸磷酸组氨酸亚磷酸无机焦磷酸磷酸酶、软骨低聚物基质蛋白及其组合。

在具体的实施方案中，和健康对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者存在慢性胰腺炎的早期损伤：igγ-1链c区、核连蛋白-2和β-2-微球蛋白。

在具体的实施方案中，相较于健康对照，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者患有慢性胰腺炎：白介素-4受体α亚单位、磷酸甘油酸酯变位酶1、二肽基肽酶2、分泌型焦磷酸蛋白24、聚糖核心蛋白、内皮细胞选择性粘附分子、巢蛋白-2、血清淀粉样p物质、神经细胞黏附分子1、磷酸赖氨酸磷酸组氨酸亚磷酸无机焦磷酸磷酸酶、软骨低聚物基质蛋白、及其组合。

在具体的实施方案中，健康对照是指未患有慢性胰腺炎的个体。

在另一个实施方案中，提供了鉴定试剂在制备用于受试者的慢性胰腺炎严重程度监测试剂中的用途，其中所述鉴定试剂特异于选自以下的蛋白：β-2-微球蛋白、t-激肽原2、碳酸酐酶1、多聚免疫球蛋白受体、聚糖核心蛋白、磷酸甘油酸酯变位酶1、二肽基肽酶2、内皮细胞选择性粘附分子、巢蛋白-2、血清淀粉样p物质、磷蛋白质分泌24、神经细胞黏附分子1、磷酸赖氨酸磷酸组氨酸亚磷酸无机焦磷酸磷酸酶、软骨低聚物基质蛋白、cd48抗原、聚糖蛋白-3、基质-重构-相关蛋白8、淀粉样βa4蛋白、硫酸软骨素蛋白多糖4、thy-1膜糖蛋白、纤连蛋白、α2-巯基糖蛋白、组织α-左旋岩藻糖苷酶、肌动蛋白胞质1、生长抑制蛋白6、凝血素、醌氧化还原酶、中性和碱性氨基酸运输蛋白质rbat、甲基多巴aβ亚基、线粒体犬尿氨酸/a-氨基乙二酸转氨酶、及其组合。

在具体的实施方案中，和健康对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者慢性胰腺炎恶化：β-2-微球蛋白和t-激肽原2、碳酸酐酶1、多聚免疫球蛋白受体；相较于健康对照，受试者中选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者慢性胰腺炎恶化：聚糖核心蛋白、磷酸甘油酸酯变位酶1、二肽基肽酶2、内皮细胞选择性粘附分子、巢蛋白-2、血清淀粉样p物质、磷蛋白质分泌24、神经细胞黏附分子1、磷酸赖氨酸磷酸组氨酸亚磷酸无机焦磷酸磷酸酶、软骨低聚物基质蛋白、cd48抗原、聚糖蛋白-3、基质-重构-相关蛋白8、淀粉样βa4蛋白、硫酸软骨素蛋白多糖4、thy-1膜糖蛋白、纤连蛋白、α2-巯基糖蛋白、组织α-左旋岩藻糖苷酶、肌动蛋白胞质1、生长抑制蛋白6、凝血素、醌氧化还原酶、中性和碱性氨基酸运输蛋白质rbat、甲基多巴aβ亚基、线粒体犬尿氨酸/a-氨基乙二酸转氨酶、及其组合。

适用于本公开的鉴定试剂是质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段。在具体的实施方案中，抗体是单克隆抗体。本公开对单克隆抗体的物种来源没有限制，任何能够结合上述蛋白的抗体均可以使用。

在具体的实施方案中，抗原结合片段包括但不限于：fab、fab'、(fab')2、fv、scfv、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、双-scfv。任何保留了抗原结合活性的抗体片段均适用于本公开。

在具体的实施方式中，根据本公开的蛋白标记物能够用于诊断和/或预后慢性胰腺炎。

在具体的实施方案中，表达水平选自核酸水平和蛋白质水平，尤其是蛋白质水平。

在具体的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，优选是人。

在具体的实施方案中，表达水平是在尿液样本中测定的。

在具体的实施方案中，所述蛋白是尿液蛋白。

根据另一些实施方案，还提供了一种用于诊断慢性胰腺炎的试剂盒或芯片，其包含选自以下的蛋白的鉴定试剂、或者由选自以下的蛋白的鉴定试剂组成：cd48抗原、igγ-1链c区、l-乳酸脱氢酶b链、na(+)/h(+)交换调节因子nhe-rf3、thy-1膜糖蛋白、t-激肽原2、v型质子atp酶亚单位s1、α2-巯基糖蛋白、α-2-巯基糖蛋白、β-2-微球蛋白、氨基酰化酶-1a、白介素-4受体α亚单位、半胱氨酸蛋白酶抑制剂-b、巢蛋白-2、淀粉样βa4蛋白、多聚免疫球蛋白受体、二肽基肽酶2、分拣蛋白、分泌型焦磷酸蛋白24、钙粘蛋白-2、谷氨酰胺基肽酶、谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位、核连蛋白-2、黄曲霉素b1醛还原酶3、肌动蛋白胞质1、基质-重构-相关蛋白8、甲基多巴aβ亚基、胶原c-肽链内切酶增强子1、聚糖蛋白-3、聚糖核心蛋白、醌氧化还原酶、磷蛋白质分泌24、磷酸甘油酸酯变位酶1、磷酸赖氨酸磷酸组氨酸亚磷酸无机焦磷酸磷酸酶、硫酸软骨素蛋白多糖4、氯胞内通道蛋白1、钠依赖的中性氨基酸载体b(0)at3、内皮细胞选择性粘附分子、凝血素、前列腺腺激肽释放酶-6、线粒体犬尿氨酸/α氨基乙二酸转氨酶、软骨低聚物基质蛋白、神经细胞黏附分子1、生长抑制蛋白6、双糖链蛋白多糖、碳酸酐酶1、唾液酸o-乙酰酯酶、纤连蛋白、血清淀粉样p物质、乙醇脱氢酶(辅酶ⅱ(+))、中性和碱性氨基酸运输蛋白质rbat、组织α-左旋岩藻糖苷酶及其组合。

在一些实施方案中，试剂盒中包含上述蛋白的鉴定试剂。在另一些实施方案中，芯片上固定有上述蛋白的鉴定试剂。在一些实施方案中，所述鉴定试剂是抗体或其抗原结合片段。

在具体的实施方案中，提供了一种用于慢性胰腺炎早期诊断的试剂盒或芯片，其包含选自以下的蛋白的鉴定试剂、或者由选自以下的蛋白的鉴定试剂组成：igγ-1链c区、核连蛋白-2、β-2-微球蛋白、白介素-4受体α亚单位、磷酸甘油酸酯变位酶1、二肽基肽酶2、分泌型焦磷酸蛋白24、聚糖核心蛋白、内皮细胞选择性粘附分子、巢蛋白-2、血清淀粉样p物质、神经细胞黏附分子1、磷酸赖氨酸磷酸组氨酸亚磷酸无机焦磷酸磷酸酶、软骨低聚物基质蛋白。

在另一些具体的实施方案中，提供了一种用于监测受试者慢性胰腺炎严重程度的试剂盒或芯片，其包含选自以下的蛋白的鉴定试剂、或者由选自以下的蛋白的鉴定试剂组成：β-2-微球蛋白、t-激肽原2、碳酸酐酶1、多聚免疫球蛋白受体、聚糖核心蛋白、磷酸甘油酸酯变位酶1、二肽基肽酶2、内皮细胞选择性粘附分子、巢蛋白-2、血清淀粉样p物质、磷蛋白质分泌24、神经细胞黏附分子1、磷酸赖氨酸磷酸组氨酸亚磷酸无机焦磷酸磷酸酶、软骨低聚物基质蛋白、cd48抗原、聚糖蛋白-3、基质-重构-相关蛋白8、淀粉样βa4蛋白、硫酸软骨素蛋白多糖4、thy-1膜糖蛋白、纤连蛋白、α2-巯基糖蛋白、组织α-左旋岩藻糖苷酶、肌动蛋白胞质1、生长抑制蛋白6、凝血素、醌氧化还原酶、中性和碱性氨基酸运输蛋白质rbat、甲基多巴aβ亚基、线粒体犬尿氨酸/a-氨基乙二酸转氨酶。

根据一些实施方案，提供了一种用于诊断受试者中慢性胰腺炎的方法，包括步骤：

1)获得受试者的尿液样本，

2)任选地，从尿液样本中分离尿蛋白，

3)确定受试者尿液样本中选自以下的蛋白的表达水平：cd48抗原、igγ-1链c区、l-乳酸脱氢酶b链、na(+)/h(+)交换调节因子nhe-rf3、thy-1膜糖蛋白、t-激肽原2、v型质子atp酶亚单位s1、α2-巯基糖蛋白、α-2-巯基糖蛋白、β-2-微球蛋白、氨基酰化酶-1a、白介素-4受体α亚单位、半胱氨酸蛋白酶抑制剂-b、巢蛋白-2、淀粉样βa4蛋白、多聚免疫球蛋白受体、二肽基肽酶2、分拣蛋白、分泌型焦磷酸蛋白24、钙粘蛋白-2、谷氨酰胺基肽酶、谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位、核连蛋白-2、黄曲霉素b1醛还原酶3、肌动蛋白胞质1、基质-重构-相关蛋白8、甲基多巴aβ亚基、胶原c-肽链内切酶增强子1、聚糖蛋白-3、聚糖核心蛋白、醌氧化还原酶、磷蛋白质分泌24、磷酸甘油酸酯变位酶1、磷酸赖氨酸磷酸组氨酸亚磷酸无机焦磷酸磷酸酶、硫酸软骨素蛋白多糖4、氯胞内通道蛋白1、钠依赖的中性氨基酸载体b(0)at3、内皮细胞选择性粘附分子、凝血素、前列腺腺激肽释放酶-6、线粒体犬尿氨酸/α氨基乙二酸转氨酶、软骨低聚物基质蛋白、神经细胞黏附分子1、生长抑制蛋白6、双糖链蛋白多糖、碳酸酐酶1、唾液酸o-乙酰酯酶、纤连蛋白、血清淀粉样p物质、乙醇脱氢酶(辅酶ⅱ(+))、中性和碱性氨基酸运输蛋白质rbat、组织α-左旋岩藻糖苷酶、及其组合。

在具体的实施方案中，使用质谱方法、elisa方法、或western方法确定表达水平。

当采用质谱方法确定蛋白及其表达水平时，在获得尿液样本的步骤之后，还可以包括消化步骤。在具体的实施方式中，用蛋白酶消化尿液样本中的蛋白。

根据一些实施方案，提供了一种用于早期诊断受试者中慢性胰腺炎的方法，包括步骤：

1)获得受试者和健康对照的尿液样本，

2)确定受试者和健康对照的尿液样本中选自以下的蛋白的表达水平：igγ-1链c区、核连蛋白-2、β-2-微球蛋白、白介素-4受体α亚单位、磷酸甘油酸酯变位酶1、二肽基肽酶2、分泌型焦磷酸蛋白24、聚糖核心蛋白、内皮细胞选择性粘附分子、巢蛋白-2、血清淀粉样p物质、神经细胞黏附分子1、磷酸赖氨酸磷酸组氨酸亚磷酸无机焦磷酸磷酸酶、软骨低聚物基质蛋白、及其组合，

3)将受试者中所述蛋白的表达水平和健康对照中所述蛋白的表达水平进行比较，

4)确定所述受试者是否患有慢性胰腺炎。

根据一些实施方案，提供了一种用于监测受试者中慢性胰腺炎严重程度的方法，包括步骤：

1)获得受试者和健康对照的尿液样本，

2)和健康对照相比，确定受试者尿液样本中选自以下的蛋白的表达水平：β-2-微球蛋白、t-激肽原2、碳酸酐酶1、多聚免疫球蛋白受体、聚糖核心蛋白、磷酸甘油酸酯变位酶1、二肽基肽酶2、内皮细胞选择性粘附分子、巢蛋白-2、血清淀粉样p物质、磷蛋白质分泌24、神经细胞黏附分子1、磷酸赖氨酸磷酸组氨酸亚磷酸无机焦磷酸磷酸酶、软骨低聚物基质蛋白、cd48抗原、聚糖蛋白-3、基质-重构-相关蛋白8、淀粉样βa4蛋白、硫酸软骨素蛋白多糖4、thy-1膜糖蛋白、纤连蛋白、α2-巯基糖蛋白、组织α-左旋岩藻糖苷酶、肌动蛋白胞质1、生长抑制蛋白6、凝血素、醌氧化还原酶、中性和碱性氨基酸运输蛋白质rbat、甲基多巴aβ亚基、线粒体犬尿氨酸/a-氨基乙二酸转氨酶、及其组合，

3)将受试者所述蛋白的表达水平和健康对照所述蛋白的表达水平进行比较，

4)确定所述受试者的慢性胰腺炎是否进展或恶化。

附图说明

图1：慢性胰腺炎组大鼠和对照组大鼠体重监测结果。●代表模型组；■代表正常对照组。*表示p<0.05；**表示p<0.01。

图2a至图2e：对照组(a)、慢性胰腺炎模型第14(b)、21(c)、28(d)和42天组(e)的大鼠胰腺组织切片he染色结果。

图3a至图3d：对照组(a)、慢性胰腺炎模型第21(b)、28(c)和42天组(d)的大鼠胰腺组织切片马松染色结果。

具体实施方式

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本申请。本领域技术人员公知，在不背离本申请精神的情况下，可以对本申请做出许多修改，这样的修改也落入本申请的范围。如无特别说明，所使用的实验材料均可从商业公司获取。

实施例

实施例1：慢性胰腺炎大鼠模型的建立

二乙基二硫代氮基甲酸钠(diethyldithiocarbamate，ddc)诱导的慢性胰腺炎大鼠模型纤维化可以模拟慢性胰腺炎疾病发生的过程(参见naokimatsumura等人，studyonfreeradicalsandpancreaticfibrosis-pancreaticfibrosisinducedbyrepeatedinjectionsofsuperoxidedismutaseinhibitorpanereas，2001，22；53-57)。观察胰腺纤维化从正常、早期纤维化、纤维化进展的整体变化，其病理过程和病理特征与人类的慢性胰腺炎相似。ddc腹腔注射引起大鼠胰腺损伤呈一个渐进性过程，且具有很好的重复性。利用该动物模型模拟慢性胰腺炎的发病过程，对临床上早期诊断、监测病情进展有重要的指导意义。

在本申请中，采用二乙基二硫代氨基甲酸钠(ddc)腹腔注射法诱导大鼠慢性胰腺炎动物模型，本申请收集慢性胰腺炎大鼠在早期阶段(第14天)和中晚阶段(第21天、28天)的尿液。利用该动物模型模拟慢性胰腺炎，对临床上慢性胰腺炎的早期诊断、治疗和预后有重要的指导意义。

1.材料与试剂

1)仪器：

大鼠代谢笼：购自北京佳源兴业科技有限公司。thermoorbitrapfusionlumos质谱仪：购自thermofisherscientific公司；thermoeasy-nlc1200高效液相色谱仪：购自thermofisherscientific公司；millliqrg超纯水系统：购自millipore公司；c18反相分析柱(rp柱，0.1×150mm，3μm，)：购自michrombioresources公司。

2)主要试剂：

二乙基二硫代氨基甲酸钠(diethyldithiocarbamate，ddc)从sigma公司购买；去离子水来源于millliqrg超纯水系统；色谱级乙腈、甲酸和甲醇为fisher公司生产；碘乙酰铵(iaa)、碳酸氢铵、二硫苏糖醇(dtt)从merck公司购买；测序级胰酶从sigma公司购买。

3)动物：

雄性wistar大鼠(体重180至200g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司，在标准饲养环境中饲养。

2.实验方法

1)慢性胰腺炎大鼠模型建立以及样品收集：

慢性胰腺炎大鼠模型建立步骤：用无菌1ml注射器腹腔注射，根据大鼠体重，注射ddc量为500mg/kg。

对照组的大鼠模型建立步骤：用无菌1ml注射器腹腔注射，根据大鼠体重，注射生理盐水量为500mg/kg。

样品收集流程：在造模之前，将大鼠置于代谢笼中收集正常尿液，造模过程中第7天、14天、21天、28天将大鼠置于代谢笼中收集尿液样本。

2)指标检测：

体重监测：每次注射ddc前测量大鼠的体重。

胰腺组织病理学：在造模第7、14、21、28、42天，将实施例1中的部分大鼠安乐死并取大鼠胰腺组织。将胰腺从每个动物中取出，并在4℃下在4％甲醛通过浸入固定。切片，后用h&e染色和masson染色观察胰腺组织发生的变化。

实施例2

1.尿蛋白提取与保存：

尿液于4℃2000g离心30分钟，取上清，置于新ep管内，继续12000g4℃离心30分钟；取上清，-80℃保存。

乙醇沉淀尿液蛋白，用bradford法测蛋白浓度后进行膜上酶切，参见wisniewskijr,zougmana,nagarajn,mannm.universalsamplepreparationmethodforproteomeanalysis.naturemethods2009；6:359-62。bca法测量多肽浓度。

2.lc-ms/ms串联质谱分析：

将多肽样本用0.1％甲酸稀释成0.5μg/μl。多肽样本通过thermo液相系统easy-nlc1200上样系统分离。洗脱时间120分钟，色谱柱流速为0.3μl/min。洗脱梯度为5％至40％流动相b(流动相a为：0.1％甲酸；流动相b为：89.9％乙腈)。洗脱下的肽段使用thermoorbitraplumos质谱仪进行分析。采用阳离子模式，母离子和子离子的分辨率为120000。

3.数据库检索：

所有质谱结果用mascot软件进行数据库检索。所用数据库为swiss-protratdatabase。检索条件为：胰酶酶切；允许有2个漏切位点；半胱氨酸为固定修饰；蛋氨酸的氧化和蛋白质n-末端乙酰化是可变修饰。thermoorbitrapfusionlumos数据质谱数据检索容许误差为：母离子0.05da，子离子0.05da。

4.相对定量分析结果：

所有质谱结果通过初级lc-ms/ms软件进行相对定量结果分析。软件操作根据文献中所示方法使用(参见haucksm,dietterj,kramerrl等人.decipheringmembrane-associatedmolecularprocessesintargettissueofautoimmuneuveitisbylabel-freequantitativemassspectrometry.molecular&cellularproteomics:mcp2010；9:2292-305)。

5.统计分析：

将不同时间点的蛋白组数据进行统计分析，筛选出于造模前0天相比谱图数变化倍数在2倍以上，p值小于0.05的蛋白作为差异蛋白。

6.实验结果：

(1)体重变化

如图1所示，从第10天起实验组的体重低于对照组，并且实验组与对照组体重有明显的统计学差异(图1)。

(2)病理检测结果

如图2a至2e，he染色结果显示：对照组，显示正常的组织结构(图2a)；ddc诱导慢性胰腺炎大鼠实验组，问质不同程度的水肿、增宽、炎性细胞细胞浸润、部分出现胰腺实质坏死、出血、胰腺导管壁增厚和细胞增多。并随着时间的推进程度加深(图2b至2e)。

如图3，马松(masson’strichromestaining)染色结果显示，对照组，显示正常的组织结构(图3a)；ddc诱导慢性胰腺炎大鼠实验组在21天开始，胰腺小叶和间隔不同程度的纤维组织增生，并随着时间的推进胰腺纤维化程度不断进展(图3b至3d)，说明造模成功。

(3)对照组和慢性胰腺炎组大鼠(n＝3)的尿液经过质谱鉴定，分别进行2次技术重复。在fdr小于1％的水平，基于两肽以上鉴定的蛋白为557个。

与0天蛋白定量的谱图数进行比对，筛选出其他时间点变化倍数在2倍以上及重复测量anovap值小于0.05的差异蛋白，同时使用uniprot数据库将大鼠蛋白转化为相应的人同源蛋白。

与对照组的相比，慢性胰腺炎14天组尿中的大鼠差异蛋白为21个、慢性胰腺炎21天组尿中的大鼠差异蛋白为32个、慢性胰腺炎28天组尿中的大鼠差异蛋白为40个。

将不同时间点的慢性胰腺炎模型与对照组大鼠尿蛋白进行比较，经过anova统计学分析以及变化倍数筛选，可靠的差异蛋白人同源的有52个，分别为：cd48抗原、igγ-1链c区、l-乳酸脱氢酶b链、na(+)/h(+)交换调节因子nhe-rf3、thy-1膜糖蛋白、t-激肽原2、v型质子atp酶亚单位s1、α2-巯基糖蛋白、β-2-微球蛋白、氨基酰化酶-1a、白介素-4受体α亚单位、半胱氨酸蛋白酶抑制剂-b、巢蛋白-2、淀粉样βa4蛋白、多聚免疫球蛋白受体、二肽基肽酶2、分拣蛋白、分泌型焦磷酸蛋白24、钙粘蛋白-2、谷氨酰胺基肽酶、谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位、核连蛋白-2、黄曲霉素b1醛还原酶3、肌动蛋白胞质1、基质-重构-相关蛋白8、甲基多巴aβ亚基、胶原c-肽链内切酶增强子1、聚糖蛋白-3、聚糖核心蛋白、醌氧化还原酶、磷蛋白质分泌24、磷酸甘油酸酯变位酶1、磷酸赖氨酸磷酸组氨酸亚磷酸无机焦磷酸磷酸酶、硫酸软骨素蛋白多糖4、氯胞内通道蛋白1、钠依赖的中性氨基酸载体b(0)at3、内皮细胞选择性粘附分子、凝血素、前列腺腺激肽释放酶-6、线粒体犬尿氨酸/α氨基乙二酸转氨酶、软骨低聚物基质蛋白、神经细胞黏附分子1、生长抑制蛋白6、双糖链蛋白多糖、碳酸酐酶1、唾液酸o-乙酰酯酶、纤连蛋白、血清淀粉样p物质、乙醇脱氢酶(辅酶ⅱ(+))、中性和碱性氨基酸运输蛋白质rbat、组织α-左旋岩藻糖苷酶。

相较于健康对照，慢性胰腺炎组中表达水平提高的尿蛋白共7个，分别为igγ-1链c区、t-激肽原2、β-2-微球蛋白、多聚免疫球蛋白受体、核连蛋白-2、前列腺腺激肽释放酶-6、碳酸酐酶1。

相较于健康对照，慢性胰腺炎组中表达水平降低的尿蛋白的45个，分别为cd48抗原、l-乳酸脱氢酶b链、na(+)/h(+)交换调节因子nhe-rf3、thy-1膜糖蛋白、v型质子atp酶亚单位s1、α2-巯基糖蛋白、氨基酰化酶-1a、白介素-4受体α亚单位、半胱氨酸蛋白酶抑制剂-b、巢蛋白-2、淀粉样βa4蛋白、二肽基肽酶2、分拣蛋白、分泌型焦磷酸蛋白24、钙粘蛋白-2、谷氨酰胺基肽酶、谷氨酰半胱氨酸合成酶催化亚单位、黄曲霉素b1醛还原酶3、肌动蛋白胞质1、基质-重构-相关蛋白8、甲基多巴aβ亚基、胶原c-肽链内切酶增强子1、聚糖蛋白-3、聚糖核心蛋白、醌氧化还原酶、磷蛋白质分泌24、磷酸甘油酸酯变位酶1、磷酸赖氨酸磷酸组氨酸亚磷酸无机焦磷酸磷酸酶、硫酸软骨素蛋白多糖4、氯胞内通道蛋白1、钠依赖的中性氨基酸载体b(0)at3、内皮细胞选择性粘附分子、凝血素、线粒体犬尿氨酸/α氨基乙二酸转氨酶、软骨低聚物基质蛋白、神经细胞黏附分子1、生长抑制蛋白6、双糖链蛋白多糖、唾液酸o-乙酰酯酶、纤连蛋白、血清淀粉样p物质、乙醇脱氢酶(辅酶ⅱ(+))、中性和碱性氨基酸运输蛋白质rbat、组织α-左旋岩藻糖苷酶。

由于在建模后第14天，慢性胰腺炎组和对照组大鼠病理检测与对照组相比未出现显著差异。因此，在慢性胰腺炎早期(造模14天)筛选出差异蛋白14个(表1)。转化为人同源蛋白后，在慢性胰腺炎早期，igγ-1链c区、核连蛋白-2和β-2-微球蛋白的表达水平提高；白介素-4受体α亚单位、磷酸甘油酸酯变位酶1、二肽基肽酶2、分泌型焦磷酸蛋白24、聚糖核心蛋白、内皮细胞选择性粘附分子、巢蛋白-2、血清淀粉样p物质、神经细胞黏附分子1、磷酸赖氨酸磷酸组氨酸亚磷酸无机焦磷酸磷酸酶、软骨低聚物基质蛋白表达量降低。

其中，有11个差异蛋白，分别为：磷酸甘油酸酯变位酶1、二肽基肽酶2、分泌型焦磷酸蛋白24、聚糖核心蛋白、内皮细胞选择性粘附分子、巢蛋白-2、血清淀粉样p物质、神经细胞黏附分子1、磷酸赖氨酸磷酸组氨酸亚磷酸无机焦磷酸磷酸酶、软骨低聚物基质蛋白、β-2-微球蛋白在慢性胰腺炎的其他阶段也有明显差异(表2)，说明了这些蛋白作为疾病早期诊断的可靠性。

表1.慢性胰腺炎早期诊断的尿液蛋白标志物

由于在建模后第21天开始，慢性胰腺炎组相比对照组大鼠病理masson染色出现明显纤维化。因此，对第14、21和28天的慢性胰腺炎组被重复鉴定到质谱差异蛋白进行汇总，可以用于检测慢性胰腺炎的病情进展(表2)。

和健康对照中的蛋白水平相比较，β-2-微球蛋白和t-激肽原2、碳酸酐酶1、多聚免疫球蛋白受体的表达水平提高；

和健康对照中的蛋白水平相比较，聚糖核心蛋白、磷酸甘油酸酯变位酶1、二肽基肽酶2、内皮细胞选择性粘附分子、巢蛋白-2、血清淀粉样p物质、磷蛋白质分泌24、神经细胞黏附分子1、磷酸赖氨酸磷酸组氨酸亚磷酸无机焦磷酸磷酸酶、软骨低聚物基质蛋白、cd48抗原、聚糖蛋白-3、基质-重构-相关蛋白8、淀粉样βa4蛋白、硫酸软骨素蛋白多糖4、thy-1膜糖蛋白、纤连蛋白、α2-巯基糖蛋白、组织α-左旋岩藻糖苷酶、肌动蛋白胞质1、生长抑制蛋白6、凝血素、醌氧化还原酶、中性和碱性氨基酸运输蛋白质rbat、甲基多巴aβ亚基、线粒体犬尿氨酸/a-氨基乙二酸转氨酶的表达水平降低。

表2.在慢性胰腺炎进展过程中蛋白表达水平的变化