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一种鉴定黄瓜杂交种纯度的方法及其使用的InDel引物组合

泰然健康网
2025-06-23 08:37

本发明属于生物，具体涉及一种鉴定黄瓜杂交种纯度的方法及其使用的indel引物组合；杂交种指杂交一代种，可能有亲本混杂。

背景技术：

1、黄瓜，作为我国蔬菜产业中不可或缺的一员，其重要性不言而喻。它不仅以其独特的口感和丰富的营养价值赢得了广大消费者的喜爱，还因其四季皆可栽培、全年供应的特性，在保障我国蔬菜市场稳定供应方面发挥着举足轻重的作用。据统计，黄瓜的栽培面积已高达139.6万公顷，占全国蔬菜栽培总面积的6.2％，这一数字充分彰显了黄瓜在我国农业经济中的重要地位。然而，随着黄瓜育种技术的不断进步和新品种的不断涌现，我们也面临着前所未有的挑战。由于我国黄瓜育种企业规模相对较小且分布零散，导致种子质量管理成为了一个亟待解决的问题。市场上假冒伪劣、纯度不达标的黄瓜种子屡见不鲜，这不仅损害了农民的切身利益，也严重影响了黄瓜产业的健康发展。

2、为了规范黄瓜种子市场，保障种子质量，我国于2017年4月正式实施了《非主要农作物品种登记办法》。这一政策的出台，极大地推动了黄瓜品种的规范化管理。截至目前，全国已申请登记的黄瓜品种数量高达1607个，其中超过93％为杂交一代种(简称杂交种)。杂交种凭借其优良的遗传特性和生产性能，在黄瓜生产中占据了主导地位。然而，杂交种在进入市场前，必须经过严格的纯度鉴定。依据现行的农作物种子检验规程(gb/t 3543.1-3543.7-1995)，黄瓜杂交种的纯度需达到98％以上，这一标准对于保障种子质量和维护市场秩序具有重要意义。然而，传统的田间纯度鉴定方法存在成本高、耗时长等弊端，难以满足现代种业发展的需求。在此背景下，基于dna的分子检测技术应运而生。该技术以其成本低廉、省时高效的优势，迅速成为鉴定黄瓜杂交种纯度的新宠。通过筛选获得基于dna检测技术的鉴定黄瓜杂交种纯度的分子标记组合，我们可以更加精准、快速地完成纯度鉴定工作，从而有效遏制假冒伪劣种子的流通，保障农民的合法权益和黄瓜产业的健康发展。因此，筛选获得基于dna检测技术的鉴定黄瓜杂交种纯度的分子标记组合显得尤为重要。

3、indel(insertion-deletion)标记即为插入缺失标记，指的是在两种亲本的全基因组序列中存在的差异，具体表现为相对于一个亲本而言，另一个亲本的基因组中有一定数量的核苷酸插入或删除。这种插入缺失标记广泛存在于不同生物体的基因组中，通常根据插入缺失位点两侧的序列设计特异性的indel标记引物。indel与snp相比，其应用更加快捷，利用普通电泳技术平台就可以进行快捷的检测，对设施和方法要求较简单并且对样品dna质量要求较低，还有学者将其与ssr扩增结果进行比对，发现其稳定性及分离效果均优于ssr；具有稳定性好、分布广、多态性高、通用性强、分型系统简单且成本较低等特点。

技术实现思路

1、本发明的目的是鉴定黄瓜杂交种纯度。

2、本发明首先保护indel位点组合，包括黄瓜基因组4个indel位点；所述4个位点如下：ind_cu1位点为位于4号染色体上第400412位核苷酸；ind_cu2位点为位于6号染色体上第18170370位核苷酸；ind_cu3位点为位于7号染色体上第183336位核苷酸；ind_cu4位点为位于5号染色体上第3748553位核苷酸。

3、所述indel位点组合具体由上述4个indel位点组成。

4、本发明还保护4对indel引物组合，包括用于扩增ind_cu1的引物组1；用于扩增ind_cu2的引物组2；用于扩增ind_cu3的引物组3；用于扩增ind_cu4的引物组4。

5、所述4对indel引物组合中，所述引物组1由seq id no：1所示的正向引物f1、seqid no：2所示的反向引物r1组成。所述引物组2由seq id no：3所示的正向引物f2、seq idno：4所示的反向引物r2组成。所述引物组3由seq id no：5所示的正向引物f3、seq id no：6所示的反向引物r3组成。所述引物组4由seq id no：7所示的正向引物f4、seq id no：8所示的反向引物r4组成。

6、上述引物组中，名称中含有“f”的引物与名称中含有“r”的引物的摩尔比具体可为1:1。

7、上述任一所述indel引物组合具体可由所述引物组1、所述引物组2、所述引物组3和所述引物组4组成。

8、本发明所保护的鉴定待测黄瓜杂交种纯度的方法，具体可包括如下步骤：

9、(1)获得n株待测黄瓜杂交种的基因组dna；

10、(2)分别以步骤(1)获得的8-12株(如8-10株、10-12株、8株、10株或12株)待测黄瓜杂交种的基因组dna为模板，分别采用所述indel引物组合中4个引物组进行pcr扩增，得到相应的pcr扩增产物；

11、(3)完成步骤(2)后，进行琼脂糖凝胶电泳，并使用仪器查看结果，统计4个引物组杂合条带的株数；杂合条带较多较清晰的引物组即为目的引物组；

12、(4)分别以步骤(1)获得的n株待测黄瓜杂交种的基因组dna为模板，分别采用目的引物组进行pcr扩增，得到相应的pcr扩增产物；

13、(5)完成步骤(4)后，采用仪器查看各个pcr扩增产物的条带，根据杂合条带的数量获得待测黄瓜杂交种的纯度。

14、上述方法中，所述“根据杂合条带的数量获得待测黄瓜杂交种的纯度”的方法可为：统计各个目的引物组显示杂合条带的株数和无条带的株数，分别计算纯度，之后求平均值；

15、纯度＝目的引物组显示杂合条带的株数/(n-目的引物组无条带的株数)×100％。

16、上述方法中，所述的pcr扩增的反应体系具体可为：5μl模板dna(50ng/μl)、10μl 2×mix、1μl的正向引物和1μl的反向引物(20μmol/l)、3μl超纯水。所述进行pcr扩增的反应程序具体可为：95℃预变性5min；95℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min。

17、上述的方法中，所述待测黄瓜杂交种可为中农15号、中农9号、津优12号、津春4号、津优2号、津优35号、中农26号、博美11号、津优48号、京研107、津优108号、华耐h1104、津绿3号、博美5032、博美517、津优10号、德瑞特d19、博美10号、博美74号、中农50号、津优308、德瑞特4号、博美6913、德瑞特79、津优335号、津优316号、津优358号、津春三号、中农37号、乾德2号、乾德117、京研403、京研207、京研402、京研1568、京研15163、京研108、京研118、京研绿箭、京研绿箭2号、京研407、京研109、沪杂6号、田骄七号、田骄八号、京研旱宝5号、宁佳3号、中农19号、申绿72、申绿64、碧玉、宁运3号、东农806、京研迷你1号、京研翠玉迷你2号、京研迷你2号、乾德1217、京研迷你白、京研玉甜156、京研迷你白1号、京研迷你5号、京研靖宝、京研迷你8号、京研迷你9号、京研迷你10号、圣研迷你中的任一种。

18、上述所述的方法中，n的数值越大，鉴定待测黄瓜杂交种纯度的准确性越高。

19、需要说明的是，本发明聚焦于黄瓜杂交种的纯度保障，特指杂交一代种，其核心挑战在于避免亲本混杂而非机械混杂，即非由多种黄瓜杂交种简单混合而成。

20、本发明提供的indel引物组合旨在实现黄瓜杂交种在种子或幼苗期的早期鉴定，从而确保杂交种的纯度，有效维护生产者和育种家的合法权益，并为黄瓜品种的种子质量管理提供技术支持。本发明提供的方法具有高通量、准确、低成本、操作简单、节约人力、物力等有点，具有十分广阔的应用前景。