基于药物代谢组学的肝毒性生物标志物研究进展
来源
中国新药与临床杂志 2020年11月，第39卷 第11期
作者
向亚兰，方平飞
中南大学湘雅二医院 药学部
中南大学临床药学研究所
摘要
药物的肝毒性一直是医药工作者关注的重点，新的肝毒性标志物的发现对降低新药开发成本和增强临床用药安全具有重要意义。药物代谢组学作为代谢组学与药学交叉结合的一门新兴学科，在毒性标志物发现、疾病预测、个体化用药方面扮演着十分重要的角色。本文结合药物代谢组学的分析流程及最新研究成果，重点综述支链氨基酸、肌酸、鞘氨醇、谷胱甘肽、酰基肉碱等肝毒性生物标志物的研究进展。
关键词
代谢组学；生物标记；化学性与药物性肝损伤
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正文
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肝脏是药物代谢处置中心，这使其极易成为毒性物质的靶器官。肝毒性是多数药物的不良反应，是新药临床前安全性评估和临床用药的重点观察指标。对于新药研发, 肝毒性是终止Ⅰ期临床试验和药物撤市的主要原因之一；同样地，在临床用药过程中也常发生因缺乏肝毒性的早期监测指标而致肝损伤的情况，严重限制了许多药物的临床应用。因此, 新药研发和临床安全用药都迫切需要特异性强、灵敏度高的新型生物标志物来准确评价药物的肝毒性, 既能有效控制研发风险和减少研发成本，又能显著增强临床用药安全。
传统毒理学通常以生化指标和组织病理学结果作为诊断肝毒性的终点，但生化数据往往灵敏度较低，且多数病变组织样本难以获得［1］。相较而言, 代谢组学可以在组织尚未发生明显损伤之前，非侵入性地确定毒性生物标志物［2］。近年来，代谢组学广泛运用于毒性研究、疾病预测和疗效评价。目前，利用代谢组学方法发现药物肝毒性生物标志物，并通过内源性代谢物的改变揭示肝毒性的机制已成为国内外的研究热点。
代谢组学和药物代谢组学
代谢组学作为“组学”领域的最新成员，是一种借助各种高通量技术分析内源性小分子代谢物在遗传、生物和环境共同作用下的集中变化的方法［3］。相较于其他组学，代谢组学有以下特点：第一，代谢物处于生物信息流的末端，其变化是各组学相互协调作用信息的最终体现，客观反映了机体的整体变化；第二，代谢物的数量远少于基因和蛋白质的数量，更利于分析与鉴定；第三，代谢分析研究中的生物标志物可以从临床前延续应用至临床，因为许多内源性代谢物（如糖、氨基酸、脂类、类固醇和三酰甘油等）与物种无关，而基因和蛋白质往往表现出物种间的差异［2］。
药物代谢组学是代谢组学技术引入药学领域发展出的一个分支，通过分析比较药物干预前和干预后生物体代谢谱的差异，帮助评价和预测药物的疗效或毒性。
药物代谢组学分析流程
药物代谢组学的分析流程基本同代谢组学一样，主要有实验模型与生物样品的选取、生物样品预处理、数据采集以及数据处理和分析等步骤［4］。
1
实验模型与生物样品的选取
选择合适的实验模型和生物样本对组学分析而言是关键的。实验模型主要有人、动物及细胞。考虑到基因多态性以及环境、饮食和生活方式等在人类受试者中差异很大，人一般只用于最后标志物的临床验证阶段，而细胞的代谢途径在物种间高度保守，不具有普遍性［5］，因此，动物模型一般是首选。动物的各类型生物样本的获取较为容易，动物的给药处理可操作性强、实验条件易控制，动物的年龄、健康状态等差异较人类受试者小［6］。代谢组学研究可以应用于各种生物样品，主要包括尿液、血液、唾液、脑脊液、细胞及组织提取液等生物体液，其中尿液和血液更易收集且处理简单，因此最为常用。
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2
生物样品预处理
为了尽量避免样品中代谢物组成的改变，使原有代谢信息最大化，样品处理应遵循“最小，最好”的基本原则，即要求尽量少操作。在必要条件下，生物样品预处理根据样品类型、生化特性和研究目的做出相应调整，但绝大多数样品都需要基本的去除蛋白质和盐颗粒等程序。目前固相萃取和液液萃取是代谢组学中最常用的样品处理方法 ［7］。相比于液液萃取，固相萃取能更有效地将分析物与干扰组分分离, 保留样品中的代谢物。尽管如此，由于分析的局限性，一些代谢物仍然难以被检测到。
3
数据采集
数据采集多借助核磁共振（NMR）、质谱（MS）和色谱分析技术。其中NMR 技术具有快速、高通量和自动化分析程度高的优点，且对极性化合物敏感，对样本处理要求低。NMR 技术能为代谢物鉴定提供原子水平上的结构信息，是其他方法难以比拟的［2］，但其灵敏度相对较低，不能在亚摩尔浓度下检测代谢物。MS 在灵敏度和重现性方面比NMR 更有优势，通常与具有高分辨率的分离技术，如液相色谱或气相色谱联用，使MS 的应用领域大为扩展。液质联用可分析不稳定、不易衍生化、难挥发的代谢物，气质联用选择性好、数据库较为健全，然而联用技术也存在对极性代谢物缺乏保留、对许多非极性代谢物缺乏分辨率等缺点［8］。针对极性代谢物分离的方法，较常用的是亲水性液相色谱法、毛细管电泳法和离子对反相色谱法等［9］。
4
数据处理与分析
对谱图复杂、信息含量丰富的原始数据的处理与分析是代谢组学技术的关键。首先，原始谱图经预处理转变为数据矩阵，再采用多元统计分析对高维数据进行降维。分析过程中最常采用的一种多元统计分析是模式识别，分为无监督法和监督法。其中，无监督法能够根据代谢成分的内在相似性或差异性对样本组别进行分类［5］，并通过同源可视化技术直观地呈现，包括主成分分析法（PCA）、非线性映射技术（NLM）和层次聚类分析（HCA）等。监督法可用来建立类别间数学模型，实现对所有类型样本的最佳分离，包括偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和人工神经网络（ANN） 等。目前PCA 和PLS-DA相结合是代谢组学分析中最常用的模式识别方法［10］。最后可根据得分图和变量预测重要度（VIP）值等筛选差异代谢物，并对所得差异代谢物进行结构鉴定和代谢通路分析。
肝毒性生物标志物
肝脏是药物代谢的主要场所，也是药物损伤发生的主要器官。目前临床用于评价肝损伤的主要指标有丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）以及总胆红素（TB）等，但这些传统的生化指标特异性不太理想，如当肌肉和心脏发生损伤时，也可引起血清ALT 和AST水平升高。此外，肝酶水平与组织病变严重程度的相关性也较差［11］。药物代谢组学的出现为肝毒性生物标志物的发现和药物肝毒性评价开辟了新渠道。
1
异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸
肝脏中富含与氨基酸代谢相关的酶，因此当药物引起肝损伤时，氨基酸代谢将会发生紊乱。其中，异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸是脂肪侧链的标准氨基酸，称为支链氨基酸（BCAAs）。以往研究显示，BCAAs 的血清水平在红霉素和补骨脂素诱导的肝毒性大鼠中发生显著性变化，提示BCAAs 可能是肝毒性标志物［12,13］。
2
利奈唑胺在重症感染患者体内的药动学
肌酸是一种含氮有机酸，由精氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸合成而来。肌酸作为机体的能量缓冲器，在能量供给中发挥着核心作用。当机体的腺苷三磷酸（ATP）储存量少，不足以维持身体能量需求时，它能迅速通过肌酸/ 磷酸肌酸系统增强细胞能量，磷酸肌酸可以可逆地将磷酸基团转移至腺苷二磷酸（ADP），从而增加ATP 水平［14］。因此，在药物肝毒性机制涉及到能量代谢的情况下，一般会出现肌酸水平的波动。在菊三七引起的肝毒性大鼠尿液中观察到肌酸水平显著升高［15］ , 印证了上述理论。
3
鞘氨醇
鞘氨醇是一种具有高度生物活性的代谢物，它不仅是细胞膜和脂蛋白的组成部分，还是细胞增殖分化、膜转运、自噬和细胞死亡的调节因子。鞘氨醇在细胞核内的积累可能导致肝细胞的凋亡，提示鞘脂代谢的波动可能与肝损伤有关［16］。LIU 等［17］采用高效液相色谱（HPLC）技术对经大黄素、雷公藤甲素和马兜铃酸处理的肝细胞进行代谢分析，结果显示鞘氨醇、C16 鞘氨醇水平显著升高，并和谷胱甘肽一起被鉴定为预测大黄素、马兜铃酸和雷公藤甲素诱导肝细胞损伤的有效工具。
4
谷胱甘肽
谷胱甘肽作为体内重要的抗氧化剂，是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸组成的三肽，在细胞内合成后通过肝细胞外排作用分别转运至胆汁和血液。其中，谷氨酸是合成谷胱甘肽的重要底物，可通过谷氨酰胺转化而成，这种转化对维持机体内谷胱甘肽含量具有一定影响。谷胱甘肽的抗氧化作用是解毒的重要机制之一，它在发挥抗氧化作用的同时，自身会被氧化成氧化型谷胱甘肽，可通过测定血液和胆汁中谷胱甘肽含量或计算谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的比值来评价肝毒性药物引起的组织氧化应激程度。但是，在不同类型的氧化应激损伤中均可观察到该指标的变化，提示谷胱甘肽作为肝毒性标志物的特异性不强［9］。因此，谷胱甘肽需要与其他肝毒性标志物一起综合运用，才有评价肝毒性的实际意义。
5
酰基肉碱
肝细胞线粒体损伤是药物导致肝毒性的主要机制之一。酰基肉碱对维持正常肝功能具有重要作用，作为线粒体脂肪酸β- 氧化的特定底物，酰基肉碱可以帮助细胞将脂肪酸传递进入线粒体［18］。当线粒体功能损伤时，会导致酰基肉碱大量累积，因此，酰基肉碱作为肝毒性预测指标具有较高的实用性。
6
尿 酸
尿酸是嘌呤代谢的最终氧化产物，其血清水平与血清肝酶水平的相关性较好，可以将其作为预测肝损伤的指标之一。但是，尿酸与氧化应激状态紧密相关，具有抗氧化防御作用［19］，这也提示尿酸作为肝毒性标志物的特异性较弱。
7
色氨酸
色氨酸也是一种必需氨基酸，在蛋白质生物合成中起着重要的作用。由于大部分色氨酸在肝脏中代谢，多数药物的肝毒性将会导致色氨酸代谢紊乱。WEI 等［11］报道，在藜芦引起的肝毒性小鼠的肝脏代谢物中色氨酸含量显著增加，推测可能与藜芦引起的炎症反应激活吲哚胺-2，3- 二氧合酶有关。
8
丙氨酸
在肝毒性代谢物中，丙氨酸是最常被报道的标志物之一，在超过40% 的肝毒性研究中，丙氨酸发生显著性改变。但是，不同肝毒性药物对丙氨酸的调节是不一致的，上调被描述为分解代谢反应，而下调被解释为自噬过程［9］。
9
牛磺酸和胆汁酸相关标志物
牛磺酸作为细胞膜稳定剂、抗氧化应激剂和离子（如钠、钾、钙和镁）转运促进剂，参与了多项细胞活动。牛磺酸可通过线粒体保护作用、抗纤维化特性、酶抑制和抗氧化等作用改善药物诱导的急慢性肝损伤［20］。在雄黄所致的亚慢性肝毒性小鼠中，尿液中的牛磺酸被认为是肝毒性标志物之一［21］。ZHAO 等［22］通过对小鼠血清和肝脏中代谢的分析，发现雷公藤甲素的肝毒性与牛磺酸、次牛磺酸的代谢有关，肝毒性模型组中牛磺酸水平的下调降低了其对雷公藤甲素诱导的氧化应激和细胞调亡的保护作用。
胆汁酸是内源性小分子，参与调节胆固醇平衡、脂质溶解和新陈代谢。异常高浓度的胆汁酸在肝内积聚，可引起肝损伤。因此，胆汁酸一直被认为是肝损伤和肝功能障碍的高度敏感标志物［23］。但是关于胆汁酸中具体某一种或几种化合物与肝毒性的关系却鲜有报道。TIAN 等［24］研究发现，血清和肝脏中牛磺胆酸（TCA）、牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）以及牛磺-α- 鼠胆酸（T-α-MCA）这三者的浓度与ALP 水平具有良好的相关性（正相关），是栀子苷肝毒性的潜在标志物。血清中胆汁酸类成分（如胆酸、甘氨胆酸、TCA、TCDCA、甘氨鹅去氧胆酸）水平的上调提示药物肝毒性类型是胆汁淤积型［25］。
10
磷脂和胆碱相关标志物
溶血卵磷脂（LysoPC）是一种重要的信号分子，参与调节细胞增殖和炎症反应，在各种肝病中起着至关重要的作用［26］。相似地，广泛存在于细胞中的胆碱也参与信号通路过程，而且胆碱的生物转化（胆碱可以被磷酸化为磷酸胆碱，继而合成磷脂酰胆碱）与肝功能损伤相关［27］。因此，如果代谢物中涉及胆碱、磷酸胆碱、磷脂酰胆碱以及LysoPC 浓度变化，均提示该药物的肝毒性可能与磷脂和胆碱代谢紊乱有关，这4 种物质均是在药物代谢组学研究中常见的肝毒性标志物。
代表性肝毒性生物标志物信息汇总详见表1。
小结与展望
药物代谢组学作为一门新兴的交叉学科，显示出在肝损伤早期发现无创标志物以及在药物毒性研究中提供代谢途径信息的潜力。新的特异、敏感的肝毒性生物标志物将有助于改善药物的开发模式，并为药物毒性评价提供依据。
尽管药物代谢组学技术在肝毒性生物标志物的筛选和鉴定方面取得了不俗进展，但大部分标志物的特异性和灵敏性尚需进一步确证。组学平台前期的研究发现还需要在大量患者群体中进行验证后才能纳入日常实践，真正能转化为可供临床使用或取代传统损伤指标的新标志物还很少。况且，生物代谢网络极具复杂性，各个通路之间交互相关，依据单一标志物往往难以做出准确的毒性评价。因此，验证新型标志物和寻找标志物之间的最佳组合可能会是今后研究的重点。同时，需将基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学整合起来综合考量，使各个组学所提供的信息最大化，提高药物毒性研究的效率。相信随着对组学技术的深入研究和标志物验证工作的进一步开展，新肝毒性生物标志物将会尽早服务于药物开发和临床实践。
参考文献
详见 中国新药与临床杂志 2020年11月，第39卷 第11期
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