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高纯度低聚半乳糖单一组分的制备方法.pdf

泰然健康网
2024-12-24 19:34

高纯度低聚半乳糖单一组分的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种高纯度低聚半乳糖单一组分的制备方法，具体地说，是以微生物酶法合成的低聚半乳糖粗品为原料，采用国产廉价易得的树脂为分离介质，通过柱层析技术得到高纯度的低聚半乳糖产品；以聚丙烯酰胺凝胶为分离介质，制备得到高纯度的低聚半乳糖单一组分产品。
背景技术
低聚半乳糖(GOS)在体内不能被胃酸和胃酶降解，故不能被消化吸收，而是直接进入小肠内被有益菌尤其是双歧杆菌利用，因此能有效促进体内双歧杆菌的生长繁殖，改善脂质代谢，促进钙的吸收和维生素的合成，并具有分解致癌物质、提高人体免疫力等功能。在自然界，动物的乳汁中含有微量的低聚半乳糖，母乳中含量较多，这正是母乳喂养的婴幼儿具有较强的免疫力和防病能力的原因。低聚半乳糖作为功能性低聚糖大量地应用于婴幼儿食品、低热量、低龋齿食品、糖尿病患者专用食品等，另外还应用于化妆品、医药、饲料和口腔清洁等非食品行业。生产制备低聚半乳糖主要有3种方法：从天然原料中提取，化学合成法和微生物酶法合成。自然界中低聚半乳糖含量少，且无色、不带电荷，很难分离提取。化学合成法需要使用大量的化学试剂，因此毒性大，易残留，在实际生产中不可行。而微生物酶法合成低聚半乳糖的β-半乳糖苷酶来源于安全无毒的霉菌和酵母，与其它方法相比，该法原料充足、方便、易得，生产成本低，是制备低聚半乳糖的最佳方法。微生物酶法合成低聚半乳糖是以高浓度乳糖做底物，在β-半乳糖苷酶的作用下，将乳糖水解的半乳糖转移到乳糖基上，制得的低聚半乳糖是在乳糖的半乳糖基一侧结合1～4分子的半乳糖的结合糖，属于葡萄糖和半乳糖组成的杂低聚糖。国内外对低聚半乳糖的制备技术研究得较多，日本、欧洲一些国家已实现大规模工业化生产，国内也有少数几个厂家在研制生产，但产量都不大。目前工业上低聚半乳糖都采用微生物酶法合成，由于酶源和反应条件的不同，最终产品的纯度也不同，约为24～57％，溶液中还存在大量未反应的乳糖、少量产物葡萄糖和极少量的半乳糖。如果产品不进行分离，一方面，未反应的乳糖得不到回收再利用；另一方面，产品中大量存在的乳糖不但会引起乳糖不耐症，在特殊人群中的食用受到一定的限制，而且很大程度上削弱了低聚半乳糖的生理功能及保健作用。虽然目前低聚半乳糖的制备技术研究得较多，但产品的下游分离纯化技术却很少有人研究，目前还没有既经济又有效的低聚半乳糖的分离纯化方法。
目前低聚糖分离纯化的方法主要有酶法、微生物发酵法、纳滤膜分离法和柱层析技术。酶法是利用酶制剂将混合物中的某些组分专一性地除去，例如混合物中的葡萄糖可以采用葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶除去，乳糖可以采用纤维二糖脱氢酶氧化为乳糖酸除去，但葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶和纤维二糖脱氢酶的价格很高，使得分离纯化操作变得不经济。微生物发酵法是利用了大多数功能性低聚糖的难发酵性，选择适当的微生物将非功能性糖组分发酵除去，低聚糖混合物中的葡萄糖可以采用酿酒酵母选择性地发酵为酒精除去，但乳糖很难发酵。纳滤技术是通过在膜两侧施加某种推动力(如压力差、浓度差等)，使得原料侧组分有选择性地透过膜，从而达到分离和提纯的目的，该技术可以除去大部分葡萄糖，但乳糖的除去率较低，因而只能粗步分离低聚半乳糖混合物，分离后的产品仍然达不到高纯度低聚糖(85％以上)的要求。另外，国内外市场对低聚糖单一组分的需求量也较大，而目前还没有适宜的的低聚半乳糖单一组分的制备方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高纯度低聚半乳糖及其单一组分的制备方法。解决目前低聚半乳糖混合物中乳糖含量较高，容易引起乳糖不耐症，从而影响产品大规模应用的问题，该方法拟采用国产廉价易得的阳离子交换树脂分离低纯度的低聚半乳糖原料，得到高纯度的低聚半乳糖产品，并采用凝胶层析技术得到高纯度的低聚半乳糖单一组分。
本发明的技术方案为：高纯度低聚半乳糖及其单一组分的制备方法，包括以下步骤：
(1)将005×7强酸性聚苯乙烯系阳离子交换树脂经酸洗、碱洗后，转为钙型，脱气后装柱，为树脂柱，聚丙烯酰胺凝胶经溶胀，倾出其中的细小颗粒，脱气后装柱，为凝胶柱；
(2)低聚半乳糖粗品经树脂柱分离，以蒸馏水为洗脱剂进行洗脱，得到纯度85％以上的低聚半乳糖产品；
(3)将步骤(2)所得低聚半乳糖产品浓缩后，采用凝胶柱一次分离，蒸馏水为洗脱剂，得到纯度85％以上的三糖、四糖和五糖单一组分。
前述的制备方法，优选的技术方案是，还包括步骤(4)：将步骤(3)所得单一组分分别浓缩后经凝胶柱二次分离，蒸馏水为洗脱剂，得到纯度98％以上的三糖、四糖和五糖单一组分。
前述的制备方法，优选的技术方案是，所述步骤(2)树脂柱长度80-100cm，直径1cm，进料量1-2mL，洗脱温度50-80℃，洗脱流速15-25mL/h。更优选的技术方案是，所述步骤(2)树脂柱长度90cm，进料量1mL，洗脱温度70℃，洗脱流速20mL/h。
前述的制备方法，优选的技术方案是，所述步骤(3)凝胶柱长度100-140cm，直径1.6cm，进料量2-4mL，洗脱温度40-70℃，洗脱流速15-25mL/h。更优选的技术方案是，所述步骤(3)凝胶柱长度120cm，进料量3mL，洗脱温度50℃，洗脱流速20mL/h。
前述的制备方法，优选的技术方案是，步骤(2)中所述低聚半乳糖粗品为微生物酶法合成的低聚糖混合物，其中低聚半乳糖的纯度为24-57％。
前述的制备方法，优选的技术方案是，树脂柱和凝胶柱的上柱样品中总糖质量浓度为200-700g/L。
前述的制备方法，优选的技术方案是，所用005×7强酸性聚苯乙烯系阳离子交换树脂的粒度为150-180μm。
前述的制备方法，优选的技术方案是，所用聚丙烯酰胺凝胶的粒度为45-90μm。
本发明的优点主要体现在于：
(1)采用005×7树脂分离低聚半乳糖混合物，可以有效地除去葡萄糖，得到纯度85％以上的含少量乳糖的低聚半乳糖产品。
(2)005×7树脂廉价易得，柱层析过程操作简单，成本低，耗时少(整个实验室操作只需要2.4h)，产品收率高，树脂硬度大、耐压、颗粒之间空隙大，有利于工业上放大生产。
(3)聚丙烯酰胺凝胶分离低聚半乳糖混合物，一次柱层析可以得到纯度85％以上的低聚半乳糖单一组分产品，二次柱层析可以得到纯度98％以上的低聚半乳糖单一组分，达到了标准品的要求。
附图说明
图1：005×7树脂柱对低聚糖半乳糖粗品的分离效果。
图2：Bio-Gel P-2凝胶柱对85％低聚糖半乳糖的分离效果。
具体实施方式
下面结合实施例和附图详细说明本发明的技术方案，但保护范围不限于此。实施例中所用原料皆可从市场购买。所用的强酸性聚苯乙烯系阳离子交换树脂，购自南开大学化工厂，型号为005×7。所用的聚丙烯酰胺凝胶，为美国Bio-Rad公司的产品，型号为Bio-GelP-2。
实施例1高纯度低聚半乳糖及其单一组分的制备方法，包括以下步骤：
(1)将005×7强酸性聚苯乙烯系阳离子交换树脂经酸洗、碱洗后，转为钙型，脱气后装柱，为树脂柱，聚丙烯酰胺凝胶经溶胀，倾出其中的细小颗粒，脱气后装柱，为凝胶柱。所用005×7强酸性聚苯乙烯系阳离子交换树脂的粒度为150-180μm。所用聚丙烯酰胺凝胶的粒度为45-90μm。
(2)低聚半乳糖粗品经树脂柱分离，以蒸馏水为洗脱剂进行洗脱，得到纯度85％以上的低聚半乳糖产品(树脂柱长度80cm，直径1cm，进料量1mL，洗脱温度80℃，洗脱流速25mL/h)；
(3)将步骤(2)所得低聚半乳糖产品浓缩后，采用凝胶柱一次分离，蒸馏水为洗脱剂，得到纯度85％以上的三糖、四糖和五糖单一组分(凝胶柱长度100cm，直径1.6cm，进料量2mL，洗脱温度40℃，洗脱流速25mL/h)。
实施例2高纯度低聚半乳糖单一组分的制备方法，与实施例1所不同的是，还包括步骤(4)：将步骤(3)所得单一组分分别浓缩后经凝胶柱二次分离，蒸馏水为洗脱剂，得到纯度98％以上的三糖、四糖或五糖单一组分。
实施例3高纯度低聚半乳糖及其单一组分的制备方法，与实施例1所不同的是，步骤(2)中树脂柱长度100cm，进料量1.5mL，洗脱温度50℃，洗脱流速15mL/h。步骤(3)中凝胶柱长度140cm，进料量4mL，洗脱温度60℃，洗脱流速15mL/h。
实施例4高纯度低聚半乳糖及其单一组分的制备方法，包括以下步骤：
(1)005×7强酸性聚苯乙烯系阳离子交换树脂经酸洗、碱洗后，转为钙型，脱气后装柱。凝胶经溶胀、倾出其中的细小颗粒，脱气后装柱。所用005×7强酸性聚苯乙烯系阳离子交换树脂的粒度为150-180μm。所用聚丙烯酰胺凝胶的粒度为45-90μm。
(2)低聚半乳糖粗品的组成为葡萄糖7.1％，乳糖40.4％，低聚糖(包括三糖、四糖和五糖)52.5％，配置溶液质量浓度为340g/L，采用005×7树脂柱对该混合物进行分离，蒸馏水为洗脱剂，树脂柱长度90cm，进料量1mL，洗脱温度70℃，洗脱流速20mL/h，每2mL收集一管，分离效果见附图1，由附图1可以看出，005×7树脂虽然对三糖、四糖和五糖之间的分离效果不明显，但对它们(低聚糖)与乳糖和葡萄糖之间的分离效果较好，收集16-19管的组分得到高纯度的低聚糖产品，其纯度为88.2％，收率为86.7％。
(3)将步骤(2)的产品浓缩至浓度340g/L，采用Bio-Gel P-2凝胶柱进行分离，蒸馏水为洗脱剂，凝胶柱长度120cm，进料量3mL，洗脱温度50℃，洗脱流速20mL/h，每3mL收集一管，分离效果见附图2，由附图2可以看出，Bio-Gel P-2不但对乳糖和三糖的分离效果较好，对三糖和四糖、四糖和五糖的分离效果也很好，分段分别收集各种组分，得到低聚三糖、四糖和五糖的纯度分别为88.7％、85.1％和86.3％，收率分别为86.9％、79.5％和81.3％。
(4)将步骤(3)中的各种产品分别浓缩至质量浓度300g/L，采用Bio-Gel P-2凝胶柱进行分离，分离条件同步骤(3)，得到纯度98％以上的低聚三糖、四糖和五糖，收率分别为95.5％、74.4％和96.7％，达到了分析用标准品的纯度要求。