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一种快速制备转糖基β－半乳糖苷酶的方法

泰然健康网
2024-12-24 19:51

专利名称：一种快速制备转糖基β－半乳糖苷酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种转糖基β-半乳糖苷酶的制备方法，尤其涉及一种可用于生产低聚半乳糖的β-半乳糖苷酶的快速制备方法。
背景技术：
低聚半乳糖是母乳中的天然组分之一，其最重要最根本的生理功能源于它对双歧杆菌的增殖作用。由于低聚半乳糖具有很好的热稳定性和耐酸性，其保健作用引起了人们的极大关注。目前，低聚半乳糖的生产主要通过微生物酶法合成，即通过β-半乳糖苷酶或乳糖酶以乳糖为底物转糖基合成。方法可以分为两类一是利用纯化酶进行反应，即在乳糖溶液中用纯化或部分纯化酶进行反应合成，该法对环境污染少，不确定的因素少，但酶的纯化过程比较繁琐，耗时耗力，酶蛋白得率低；二是利用微生物完整细胞进行反应，方法有三种用甲苯处理过的细胞生产低聚半乳糖，但甲苯的残留会对产品造成污染；或直接用细胞生产低聚半乳糖，但反应时间长(3天)，而且产量低；或采用细胞发酵的方法，即将细胞接种于乳糖培养基中培养，获得低聚半乳糖，但反应时间长(3天)，而且发酵液中有大量的微生物代谢产物及残留的培养基成分，不利于低聚半乳糖的分离纯化。因此，寻求一种快速有效的β-半乳糖苷酶制备方法，建立简单有效的转糖基反应体系，不仅可以简化工业化生产低聚半乳糖的工艺，还能大大节约成本。

发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种转糖基β-半乳糖苷酶的快速制备方法，利用本发明的方法制得的β-半乳糖苷酶可高效生产低聚半乳糖，并且本发明的方法适用于多种胞内转糖基β-半乳糖苷酶产生菌。
本发明涉及的快速制备转糖基β-半乳糖苷酶的方法，由下述步骤组成(1)菌株选择选择胞内转糖基β-半乳糖苷酶产生菌；(2)菌种活化将上述选择的菌种之一，接种于新鲜斜面培养基上活化培养1～2次，活化条件细菌35～40℃培养16～24小时，真菌于26～30℃培养48～72小时；其中所述细菌用斜面培养基配方为乳糖10±2g/L，蛋白胨542g/L，酵母粉10±2g/L，NaCl3±2g/L，琼脂20±2g/L，pH 7.0～7.5；所述真菌用斜面培养基配方为土豆汁(土豆200±2g/L)，乳糖10±2g/L，琼脂20±2g/L，自然pH；(3)菌种培养及产酶将上述活化菌接种于产酶发酵培养液中，细菌于35～40℃摇床培养16～20小时；真菌于26～30℃摇床培养40～50小时，摇床转速为180转/分，然后以相同培养液、相同条件继续转接再扩大培养，直至扩大培养至所需菌量；上述产酶发酵培养基配方依据选择菌株而定，其组分一般至少含有乳糖10～20g/L，蛋白胨5±2g/L，酵母粉10±2g/L；(若菌株产生的转糖基β-半乳糖苷酶为诱导酶，则培养基中必须加入乳糖)(4)收集菌细胞待上述培养达到所需菌量后，以12,000转/分离心1～5分钟，收集产酶发酵培养液中的细菌或单细胞酵母；霉菌用滤纸抽滤获得菌细胞；(5)洗涤将上述收集的菌细胞，以w/v＝mg/μL计，按菌细胞∶缓冲液＝1∶5的比例，将菌细胞悬浮于缓冲液中，混匀后，离心，倾去上清液；(6)制备转糖基β-半乳糖苷酶粗酶液将上述离心后收集的菌细胞，以w/v＝mg/μL计，按菌细胞∶缓冲液＝1∶1的比例，将菌细胞重悬于上述缓冲液中，于-20℃以下温度完全冷冻后，再置室温解冻，共冻融2～5次，如此菌细胞悬液即为β-半乳糖苷酶粗酶液；(7)应用粗酶液生产低聚半乳糖将上述粗酶液以体积比计，按粗酶液∶乳糖溶液＝1∶3的比例混合，于40～60℃进行转糖基反应4～10小时，其中乳糖溶液浓度为30％重量体积百分比，溶剂是上述缓冲液，待反应完毕后，12,000转/分离心1～5分钟，上清液即含有转糖基反应产物低聚半乳糖；(8)低聚半乳糖定量分析取步骤(7)制得的上清液，以高效液相色谱(HPLC)和薄层扫描定量分析低聚半乳糖得率。
具体方法是取步骤(7)制得的上清液用0.2μm的滤膜过滤后，用上述缓冲液稀释成重量体积百分比为5％的反应产物溶液，以高效液相色谱(High Performance LiquidChromatography，HPLC)定量分析低聚半乳糖得率；取步骤(7)制得的上清液在薄层层析板上点样后，在展层剂(正丁醇∶乙醇∶水＝5∶3∶2)中展开，雾喷显色剂(20％硫酸溶液+0.5％的3，5-二羟基甲苯)，于120℃烘烤10分钟，糖斑点显色后，进行薄层扫描定量分析低聚半乳糖得率。
其中，上述胞内转糖基β-半乳糖苷酶产生菌优选阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5CGMCC 1401、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)ATCC 31382、米曲霉(Aspergillusoryzae)ATCC 20423、拟热带假丝酵母(Candidapseudotropicalis)ATCC 46764、简青霉(Penicillium simplicissimum)ATCC 90288之一。
其中，上述菌种活化条件优选是细菌37℃培养18～20小时，真菌于28℃培养48～60小时。
其中，上述细菌用斜面培养基配方优选为乳糖10/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，NaCl 3g/L，琼脂20g/L，pH 7.2～7.5。
其中，上述真菌用斜面培养基配方优选为土豆200g/L，乳糖10g/L，琼脂20g/L，自然pH。
其中，上述步骤(3)所述菌种培养及产酶条件优选是细菌于37℃摇床培养16～18小时；真菌于28℃摇床培养40～48小时。
其中，上述缓冲液优选是pH 5.4的50mmol/L醋酸钠缓冲液、pH 6.5～7.5的50mmol/L磷酸钾缓冲液之一。
在本发明的快速制备转糖基β-半乳糖苷酶的方法中，采用冻融菌细胞处理工艺，不完全破坏细胞结构，但增加了细胞膜通透性，有效提高了酶的产出率，同时也提高了酶的作用效果，由于本发明方法制备的是β-半乳糖苷酶粗酶液，因此，酶的制备简便、快速，既简化了工业化生产中繁杂的纯化工艺，又节约了成本，其所制备的β-半乳糖苷酶粗酶液又不失纯化酶的效果，具有广阔的工业应用前景；并且利用本发明方法制备的β-半乳糖苷酶粗酶液产量高，作用强，反应快，同时本发明的方法还克服了现有技术中有毒有机溶液对产品的污染；制备的β-半乳糖苷酶粗酶液可以直接用于乳品工业中乳糖的水解及其它转半乳糖基反应。
具体实施例方式
实施例1制备阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5CGMCC 1401转糖基β-半乳糖苷酶粗酶液将阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5CGMCC No.1401(于2005年6月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.1401)接种至新鲜斜面培养基活化后，接一环到50mL产酶发酵培养液，于37℃摇床培养16小时，摇床转速为180转/分，或培养后再转接入500mL相同产酶发酵培养液扩大培养，培养结束后，12,000转/分离心3分钟，收获阴沟肠杆菌细胞。
上述斜面培养基配方乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，NaCl 3g/L，琼脂20g/L，pH 7.5；上述产酶发酵培养基配方乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，NaCl 3g/L，pH 7.5。
取50mg上述制备的阴沟肠杆菌细胞，加250μL、pH 7.0的50mmol/L磷酸钾缓冲液洗涤一次，阴沟肠杆菌细胞再重悬浮于50μL相同的缓冲液，-20℃以下完全冷冻后，再置室温解冻，再重复冻融1次，所得悬液即为β-半乳糖苷酶粗酶液。
应用β-半乳糖苷酶粗酶液生产低聚半乳糖取100μL上述粗酶液，加入300μL、pH 7.0磷酸钾缓冲液配制的30％(w/v)乳糖溶液，于50℃水浴摇床反应4小时，12,000转/分离心3分钟，上清即含转糖基产物——低聚半乳糖。
对上述产物进行高效液相色谱分析和薄层扫描分析，低聚半乳糖得率约为54.5％。
上述HPLC分析所用设备及条件岛津(SHIMADZU)高效液相色谱仪；岛津RID-10A示差检测器；BIO-RAD Aminex HPX-42C柱(300mm×7.8mm)；流动相为三蒸水，流速为0.2mL/min，柱温80℃；结果分析软件为Class-VP6.0。转糖基产物用0.2μm滤膜过滤后，稀释成5％(w/v)的糖溶液，进样分析。
上述薄层扫描分析所用设备及条件岛津(SHIMADZU)CS-9301双波长飞点薄层扫描仪；检测波长为550nm。取0.5uL转糖基产物在薄层层析板(Silica gel60，No.553，Merck)上点样后，在展层剂(正丁醇∶乙醇∶水＝5∶3∶2)中展开，雾喷显色剂(20％硫酸溶液+0.5％的3，5-二羟基甲苯)，于120℃烘烤10分钟，糖斑点显色后，进行扫描分析。
实施例2制备环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)ATCC 31382转糖基β-半乳糖苷酶粗酶液环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)ATCC 31382菌种经斜面培养基活化后，接一环到50mL产酶发酵培养液中，于37℃摇床培养18小时，摇床转速为180转/分，或培养后再转接入500mL相同产酶培养液扩大培养，培养结束后，12,000转/分离心2分钟获得菌细胞。
上述斜面培养基配方同实施例1。
上述产酶发酵培养基配方乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，CaCl20.11g/L，MnSO40.001g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，KH2PO40.05g/L，FeSO4·7H2O 0.03g/L，pH 7.0。
取50mg上述制备的菌细胞，加250μL pH7.5的50mmol/L磷酸钾缓冲液洗涤一次，菌细胞再重悬浮于50μL相同缓冲液中，于-20℃以下温度完全冷冻后，置室温解冻，再重复冻融2次，所得悬液即为β-半乳糖苷酶粗酶液。
应用β-半乳糖苷酶粗酶液生产低聚半乳糖取100μL粗酶液，加入300μL pH7磷酸钾缓冲液配制的30％(w/v)乳糖溶液，60℃反应6小时，12,000转/分离心2分钟，上清即为转糖基产物。
对上述产物进行高效液相色谱分析和薄层扫描分析，低聚半乳糖得率为42.7％。
上述HPLC分析和薄层扫描分析所用设备及条件同实施例1。
实施例3制备米曲霉(Aspergillus oryzae)ATCC 20423转糖基β-半乳糖苷酶粗酶液米曲霉(Aspergillus oryzae)ATCC 20423菌种经斜面培养基活化后，接一环孢子到50mL产酶培养液中，于28℃摇床培养40小时，摇床转速为180转/分，或培养后再转接入500mL相同产酶培养液扩大培养，培养结束后，用滤纸(双圈牌101快速定性滤纸)抽滤获得菌细胞。
上述斜面培养基配方土豆汁(土豆200g/L)，乳糖10g/L，琼脂20g/L，自然pH；上述产酶发酵培养基配方乳糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，NaCl 3g/L，pH 6.5。
取50mg菌细胞，加250μL pH5.4的50mmol/L醋酸钠缓冲液洗涤一次，菌细胞再重悬浮于50μL相同缓冲液中，于-20℃以下温度完全冷冻后，置室温解冻，再重复冻融4次，所得悬液即为β-半乳糖苷酶粗酶液。
取100μL粗酶液，加入300μL pH5.4醋酸钾缓冲液配制的30％(w/v)乳糖溶液，55℃反应8小时，12,000转/分离心5分钟，上清即为转糖基产物。
对上述产物进行高效液相色谱分析和薄层扫描分析，低聚半乳糖得率为34.3％。
上述HPLC分析和薄层扫描分析所用设备及条件同实施例1。
实施例4制备拟热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)ATCC 46764转糖基β-半乳糖苷酶粗酶液拟热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)ATCC 46764菌种经斜面培养基活化后，接一环到50mL产酶培养液，于28℃摇床培养48小时，摇床转速为180转/分，再转接入500mL相同培养液中以相同条件培养。12,000转/分离心4分钟获得菌细胞。
上述斜面培养基配方同实施例3；上述产酶培养基配方葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 3g/L，自然pH。
取50mg菌细胞，加250μL pH 7.2的50mmol/L磷酸钾缓冲液洗涤一次，菌细胞再重悬浮于50μL相同缓冲液中，于-20℃以下温度完全冷冻后，再置室温解冻，再重复冻融3次，所得悬液即为β-半乳糖苷酶粗酶液。
取100μL粗酶液，加入300μL pH 7.2磷酸钾缓冲液配制的30％(w/v)乳糖溶液，40℃反应8小时，12,000转/分离心4分钟，上清即为转糖基产物。
对上述产物进行高效液相色谱分析和薄层扫描分析，低聚半乳糖得率为33.5％。
上述HPLC分析和薄层扫描分析所用设备及条件同实施例1。
实施例5制备简青霉(Penicillium simplicissimum)ATCC 90288转糖基β-半乳糖苷酶粗酶液按实施例3方法培养简青霉(Penicillium simplicissimum)ATCC 90288，获得菌细胞，制得β-半乳糖苷酶粗酶液，取100μL粗酶液，加入300μL pH6.5的磷酸钾缓冲液配制的30％(w/v)乳糖溶液，50℃反应7小时，12,000转/分离心5分钟，按实施例1方法进行结果分析，低聚半乳糖得率为40.9％。
权利要求
1.一种快速制备转糖基β-半乳糖苷酶的方法，由下述步骤组成(1)菌株选择选择胞内转糖基β-半乳糖苷酶产生菌；(2)菌种活化将上述选择的菌种之一，接种于新鲜斜面培养基上活化培养1～2次，活化条件细菌35～40℃培养16～24小时，真菌于26～30℃培养48～72小时；其中所述细菌用斜面培养基配方为乳糖10±2g/L，蛋白胨5±2g/L，酵母粉10±2g/L，NaCl3±2g/L，琼脂20±2g/L，pH 7.0～7.5；所述真菌用斜面培养基配方为土豆200±2g/L，乳糖10±2g/L，琼脂20±2g/L，自然pH；(3)菌种培养及产酶将上述活化菌接种于产酶发酵培养液中，细菌于35～40℃摇床培养16～20小时；真菌于26～30℃摇床培养40～50小时，摇床转速为180转/分，然后以相同培养液、相同条件继续转接再培养，直至扩大培养至所需菌量；上述产酶发酵培养基配方依据选择菌株而定，其组分中一般至少含有乳糖10～20g/L，蛋白胨5±2g/L，酵母粉10±2g/L；(4)收集菌细胞待上述培养达到所需菌量后，以12,000转/分离心1～5分钟，收集产酶发酵培养液中的细菌或单细胞酵母；霉菌用滤纸抽滤获得菌细胞；(5)洗涤将上述收集的菌细胞，以w/v＝mg/μL计，按菌细胞∶缓冲液＝1∶5的比例，将菌细胞悬浮于缓冲液中，混匀后，离心，倾去上清液；(6)制备转糖基β-半乳糖苷酶粗酶液将上述离心后收集的菌细胞，以w/v＝mg/μL计，按菌细胞∶缓冲液＝1∶1的比例，将菌细胞重悬于上述缓冲液中，于-20℃以下温度完全冷冻后，再置室温解冻，共冻融2～5次，如此菌细胞悬液即为β-半乳糖苷酶粗酶液；(7)应用粗酶液生产低聚半乳糖将上述粗酶液以体积比计，按粗酶液∶乳糖溶液＝1∶3的比例混合，于40～60℃进行转糖基反应4～10小时，其中乳糖溶液浓度为30％重量体积百分比，溶剂是上述缓冲液，待反应完毕后，12,000转/分离心1～5分钟，上清液即含有转糖基反应产物低聚半乳糖；(8)低聚半乳糖定量分析取步骤(7)制得的上清液，以高效液相色谱(HPLC)和薄层扫描定量分析低聚半乳糖得率。
2.如权利要求1所述的快速制备转糖基β-半乳糖苷酶的方法，其特征是，所述胞内转糖基β-半乳糖苷酶产生菌选阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)B5CGMCC 1401、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)ATCC 31382、米曲霉(Aspergillus oryzae)ATCC 20423、拟热带假丝酵母(Candida pseudotropicalis)ATCC 46764、简青霉(Penicilliumsimplicissimum)ATCC 90288之一。
3.如权利要求1所述的快速制备转糖基β-半乳糖苷酶的方法，其特征是，所述菌种活化条件是细菌37℃培养18～20小时，真菌于28℃培养48～60小时。
4.如权利要求1所述的快速制备转糖基β-半乳糖苷酶的方法，其特征是，所述细菌用斜面培养基配方为乳糖10/L，蛋白胨5g/L，酵母粉10g/L，NaCl 3g/L，琼脂20g/L，pH 7.2～7.5。
5.如权利要求1所述的快速制备转糖基β-半乳糖苷酶的方法，其特征是，所述真菌用斜面培养基配方为土豆200g/L，乳糖10g/L，琼脂20g/L，自然pH。
6.如权利要求1所述的快速制备转糖基β-半乳糖苷酶的方法，其特征是，步骤(3)所述菌种培养及产酶条件是细菌于37℃摇床培养16～18小时；真菌于28℃摇床培养40～48小时。
7.如权利要求1所述的快速制备转糖基β-半乳糖苷酶的方法，其特征是，所述缓冲液是pH 5.4的50mmol/L醋酸钠缓冲液或pH6.5～7.5的50mmol/L磷酸钾缓冲液。
全文摘要
本发明公开了一种快速制备转糖基β－半乳糖苷酶的方法，由(1)菌株选择(2)菌种活化(3)菌种培养及产酶(4)收集菌细胞(5)洗涤(6)冻融制备转糖基β－半乳糖苷酶粗酶液(7)应用粗酶液生产低聚半乳糖(8)低聚半乳糖定量分析等步骤组成。本发明的方法简便、快速，成本低，制备的β－半乳糖苷酶粗酶液产量高，作用强，反应快，同时还避免了有毒有机溶液的污染；粗酶液可以直接用于乳品工业中乳糖的水解及其它转半乳糖基反应。
文档编号C12N9/38GK1737132SQ20051004409
公开日2006年2月22日申请日期2005年7月21日优先权日2005年7月21日
发明者肖敏, 卢丽丽申请人:山东大学