包含高含量低聚半乳糖(GOS)的乳产品及其生产的制作方法

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• 2024-12-24 19:55

序列表

本发明包含序列表，将其通过引用并入本文。

发明领域

本发明涉及包含高含量的原位产生的低聚半乳糖(gos)的乳产品及其生产方法。

发明背景

低聚半乳糖(gos)可以通过β-半乳糖苷酶的酶促转半乳糖基反应由乳糖产生。已经显示gos可以促进人的大肠中双歧杆菌、健康微生物的生长。因此，产生包含高含量gos的乳产品是有益和期望的。

据报道，来自乳糖的gos产量随乳糖浓度增加而增加。

gos可以从乳糖溶液异位产生，并作为成分添加至乳制品中。这将增加乳制品中的卡路里，并且另外最终产品上应标明gos的添加。这违背了普遍的“清洁标记”趋势，即许多消费者偏爱仅包含被认为是天然的成分而无添加剂或添加剂很少的“天然”产品。

因此，优选原位产生gos，即乳产品中的gos由已经存在于乳中的乳糖来制备。但是，很难原位产生高水平的gos。

在ep0458358a1中，将脱脂乳浓缩至总固体含量为按重量计20％-50％。通过将浓缩乳与β-半乳糖苷酶在20℃-50℃的温度下孵育，然后进行喷雾干燥，推测可以获得含有按重量计总量为约5％-15％的gos(推测为dp2+)的脱脂乳粉。假设浓缩脱脂乳中游离碳水化合物(乳糖和衍生物)的总含量为干物质的约50％，这相当于总游离碳水化合物的10％-30％dp2+gosw/w的相对量。举例说明了包含总量为10.5％dp2+gosw/w的脱脂乳粉的产生。

chen等人(2002),“optimizationoftheenzymicprocessformanufacturinglow-lactosemilkcontainingoligosaccharides”[用于制造含有寡糖的低乳糖乳的酶法的优化],processbiochemistry[过程生物化学]38,801-808已经比较了直接使用β-半乳糖苷酶将乳中的乳糖转化成gos与应用超滤技术分离乳糖和乳蛋白然后将渗透物中的乳糖转化成gos。当使用含有16.7％乳糖的浓缩乳时，可以通过在47℃下孵育1.4h来获得乳产品，其中22.8％w/w的乳糖被转化为dp3+gos。而通过超滤去除乳蛋白从而通过蒸发将渗透物中的乳糖浓度提高至25.3％，可以通过在50℃下孵育3.5h来获得渗透物，其中多达31.1％w/w的乳糖被转化为dp3+gos。

wo2015/086746披露了通过用由887个氨基酸组成的来自两歧双歧杆菌的截短的β-半乳糖苷酶处理包含例如脱脂乳、乳脂和乳糖的乳基介质，将低浓度乳糖(至多15％w/v)高效地转化为gos。还披露了乳基底物，其在酶处理后包含总量为0.1％至10％(w/v)的gos。这些实例显示了gos从已添加乳糖的乳基介质产生。在45℃或更低的温度下孵育，并且产生了总量高达3.7％(w/v)的dp3+gos。

本发明的目的是由乳中已经存在的乳糖在乳产品中原位产生高水平的gos，并提供具有高浓度原位产生的gos的乳产品。

技术实现要素：

本发明提供了乳产品，其包含总量为至少11wt％的原位产生的dp3+低聚半乳糖(gos)，并且其中该原位产生的dp3+gos构成总游离碳水化合物的至少35wt％。

本发明还提供了用于产生乳产品的方法，其包括：

(a)提供包含至少20wt％乳糖的乳底物，

(b)使该乳底物与具有转半乳糖基活性的酶接触至少45分钟，

(c)使该酶完全或部分失活，和

(d)由此获得乳产品，其中总游离碳水化合物的至少35wt％是原位产生的dp3+低聚半乳糖(gos)。

在优选的实施例中，总游离碳水化合物的至少50wt％是原位产生的dp2+gos。

具体实施方式

乳产品

非常需要包含低聚半乳糖(gos)的乳产品。gos可以是二糖(dp2)(除了根据定义不是gos的乳糖以外)、三糖(dp3)、四糖(dp4)、五糖(dp5)或更长的寡糖。dp是聚合度的缩写。

在本发明的上下文中，术语“dpx+gos”意指具有dpx或更高dp的gos分子的总称。例如，术语“dp3+”意指具有dp3、dp4、dp5、dp6等的gos分子的总称。

因此，dp3+gos是聚合度为至少3的gos。即，dp3+gos是三糖、四糖、五糖和更长的寡糖。dp3+gos是根据纤维定义，并且可以这样声明。乳业有兴趣声明其乳制品中gos的含量以及纤维的含量。

高含量的原位产生的gos或原位产生的纤维(dp3+gos)特别令人感兴趣。

本发明提供了乳产品，其包含总量为至少11wt％的原位产生的dp3+低聚半乳糖(gos)，并且其中该原位产生的dp3+gos构成总游离碳水化合物的至少35wt％。

游离碳水化合物是未与蛋白质共价结合的碳水化合物。

在其中碳水化合物尚未例如通过酶处理操作的乳产品中，绝大多数的游离碳水化合物是乳糖。

在本发明的乳产品中原位产生的gos已经在乳底物中由此处存在的乳糖产生。如果通过添加预产生的gos来丰富乳产品，则此类gos不是原位产生的。

优选地，乳产品获得自除了调节脂肪含量和/或水以外没有通过添加和/或去除乳成分在很大程度上改变组成的乳。显然，在本上下文中，为了将乳产品中的乳糖转化为gos而添加的具有转半乳糖基活性的酶并不被认为是乳成分。

在一个实施例中，从这样的乳获得乳产品，该乳仅通过调节脂肪含量和/或水并通过添加转半乳糖基酶而改变组成。

脂肪含量和/或水的调节可能已经通过本领域已知的任何方法例如通过离心、蒸发、冷凝、超滤、纳米过滤、冷冻干燥、喷雾干燥、通过添加水进行重构等进行。

在一些实施例中，例如蛋白质含量或乳糖含量也可能已经通过例如乳制品公司略微调节，例如以获得具有明确定义的“标准”组成的乳产品。

优选地，乳产品是由乳产生的，而不改变乳清蛋白与酪蛋白的比率。优选地，乳清蛋白与酪蛋白的比率与乳中的相同。

在优选的实施例中，乳产品不包含添加的乳糖。在另一个优选的实施例中，例如通过添加/去除最初存在的乳糖的至多20％、优选至多10％，仅略微调节了在从中产生乳产品的乳底物中的乳糖含量。

在优选的实施例中，乳产品中没有添加或去除乳蛋白。在另一个优选的实施例中，例如通过添加/去除最初存在的乳蛋白的至多20％、优选至多10％，仅略微调节了乳产品中的乳蛋白含量。这意味着，除了因去除或添加脂肪或水而引起的相对变化外，总体乳蛋白含量与生乳中的总体乳蛋白含量在很大程度上相同。

在优选的实施例中，与最初存在的乳蛋白相比，乳产品中已经添加或去除至多20％、优选至多10％的乳蛋白。

在另一个优选的实施例中，乳产品包含总量为至少10wt％的乳蛋白，如至少15wt％或至少20wt％的乳蛋白。

作为实例，脱脂乳粉通常是由生乳产生的，而对乳糖和乳蛋白含量没有任何调节或仅有略微调节。通常，脱脂乳粉包含约50wt％乳糖和约35wt％乳蛋白。因此，60％脱脂乳溶液通常包含约30wt％乳糖和约21wt％乳蛋白。如果gos是在脱脂乳粉的这种溶液中由此处存在的乳糖产生的，则此类gos是在本发明的上下文中的原位产生的gos。如果将包含原位产生的gos的脱脂乳粉的溶液喷雾干燥，则获得的乳粉将是包含根据本发明的原位产生的gos的乳产品。

而如果gos是预产生的并且作为成分添加至脱脂乳粉或脱脂乳粉的溶液中，则此类gos在本发明的上下文中不是原位产生的。

根据本发明的乳产品还可以是例如包含原位产生的gos的浓缩乳，如炼乳。或者包含原位产生的gos的经喷雾干燥的浓缩乳。

可以将根据本发明的乳产品稀释(如果乳产品是液体产品，如重构乳粉或浓缩乳)或溶解(如果乳产品是乳粉)以产生具有高相对水平的原位产生的gos的乳饮品。或者根据本发明的乳产品可以用作例如具有高相对水平的原位产生的gos的蛋白棒、婴儿配方食品或酸奶的生产中的成分。

在优选的实施例中，乳产品是重构乳粉如重构脱脂乳粉，浓缩乳如炼乳，或乳粉如脱脂乳粉。在更优选的实施例中，乳产品是脱脂乳粉或重构脱脂乳粉。

在优选的实施例中，乳产品包含至少40wt％，优选至少45wt％、至少50wt％、至少55wt％、至少57wt％或至少60wt％的干物质。在另一个优选的实施例中，乳产品是包含至少40wt％、优选至少45wt％、至少50wt％、至少55wt％、至少57wt％或至少60wt％干物质的重构乳粉(如重构脱脂乳粉)或浓缩乳(如炼乳)。在另一个优选的实施例中，乳产品是包含至少40wt％、优选至少45wt％、至少50wt％、至少55wt％、至少57wt％或至少60wt％干物质的重构脱脂乳粉。

在另一个优选的实施例中，乳产品是乳粉，优选脱脂乳粉。

在优选的实施例中，乳产品包含40wt％-100wt％，优选45wt％-100wt％、50wt％-100wt％、55wt％-100wt％、57wt％-100wt％或60wt％-100wt％的干物质。在另一个优选的实施例中，乳产品包含50wt％-70wt％的干物质，优选55wt％-65wt％的干物质，如约60wt％的干物质。

在本发明的乳产品中，原位产生的dp3+gos构成总游离碳水化合物的至少35wt％。在优选的实施例中，总游离碳水化合物的至少40wt％是原位产生的dp3+gos。

在另一个优选的实施例中，总游离碳水化合物的35wt％-70wt％，优选40wt％-70wt％、更优选40wt％-60wt％或40wt％-50wt％是原位产生的dp3+gos。

总游离碳水化合物中dp3+gos的wt％可以通过本申请的实例的方法确定。

在优选的实施例中，总游离碳水化合物的至少50wt％，优选至少55wt％或至少60wt％是原位产生的dp2+gos。

在另一个优选的实施例中，总游离碳水化合物的50wt％-80wt％，优选55wt％-80wt％或60wt％-80wt％、更优选50wt％-70wt％或60wt％-70wt％是原位产生的dp2+gos。

总游离碳水化合物中dp2+gos的wt％可以通过本申请的实例的方法确定。

本发明的乳产品包含总量为至少11wt％的原位产生的dp3+gos。在优选的实施例中，乳产品包含总量为至少12wt％，优选至少13wt％的原位产生的dp3+gos。

在另一个优选的实施例中，乳产品包含11wt％-25wt％，优选12wt％-25wt％或13wt％-25wt％的原位产生的dp3+gos。在另一个优选的实施例中，乳产品包含11wt％-15wt％、12wt％-15wt％或13wt％-15wt％的原位产生的dp3+gos。

在优选的实施例中，乳产品包含总量为至少12wt％、优选至少15wt％或至少18wt％的原位产生的dp2+gos。

在另一个优选的实施例中，乳产品包含12wt％-35wt％，优选15wt％-35wt％或18wt％-35wt％的原位产生的dp2+gos。在另一个优选的实施例中，乳产品包含12wt％-20wt％、15wt％-20wt％或18wt％-20wt％的原位产生的dp2+gos。

在优选的实施例中，乳产品中总游离碳水化合物的至多30wt％，优选至多20wt％是乳糖。在另一个优选的实施例中，乳产品中总游离碳水化合物的0-30wt％，优选0-20wt％是乳糖。

在另一个实施例中，乳产品中总游离碳水化合物的至多15wt％或至多12wt％是乳糖。在另一个实施例中，乳产品中总游离碳水化合物的0-15wt％或0-12wt％是乳糖。

在优选的实施例中，乳产品是包含总量为至少11wt％、优选至少12wt％或至少13wt％的原位产生的dp3+gos的重构乳粉(如重构脱脂乳粉)或浓缩乳(如炼乳)。在另一个优选的实施例中，乳产品是包含总量为11wt％-20wt％、优选12wt％-20wt％或13wt％-20wt％、更优选11wt％-15wt％、12wt％-15wt％或13wt％-15wt％的原位产生的dp3+gos的重构乳粉(如重构脱脂乳粉)或浓缩乳(如炼乳)。这种乳产品优选包含总量为至多10wt％，优选至多5wt％的乳糖。

在优选的实施例中，乳产品是包含总量为至少11wt％、优选至少12wt％或至少13wt％的原位产生的dp3+gos的乳粉，如脱脂乳粉。在另一个优选的实施例中，乳产品是包含总量为11wt％-40wt％、优选12wt％-40wt％或13wt％-40wt％、更优选11wt％-30wt％、12wt％-30wt％或13wt％-30wt％的原位产生的dp3+gos的乳粉，如脱脂乳粉。在另一个优选的实施例中，乳产品是包含总量为至少15wt％、优选至少18wt％或至少20wt％的原位产生的dp3+gos的乳粉，如脱脂乳粉。在另一个优选的实施例中，乳产品是包含总量为15wt％-40wt％、优选18wt％-40wt％或20wt％-40wt％、更优选15wt％-30wt％、18wt％-30wt％或20wt％-30wt％的原位产生的dp3+gos的乳粉，如脱脂乳粉。这种乳产品优先包含总量为至多15wt％，优选至多10wt％的乳糖。

乳产品可能已经进行了本领域已知的处理，例如巴氏灭菌、esl处理或uht处理。

用于产生乳产品的方法

本发明还提供了用于产生乳产品的方法，其包括：

(a)提供包含至少20wt％乳糖的乳底物，

(b)使该乳底物与具有转半乳糖基活性的酶接触至少45分钟，

(c)使该酶完全或部分失活，和

(d)由此获得乳产品，其中总游离碳水化合物的至少35wt％是原位产生的dp3+低聚半乳糖(gos)。

在本发明的方法中，通过使包含乳糖的乳底物与将乳底物中的乳糖转化为gos的转半乳糖基酶接触，由乳底物产生乳产品。

该方法中使用的乳底物是基于乳的。术语“乳”，在本发明的背景中，应理解为对任何哺乳动物如牛、绵羊、山羊、水牛或骆驼挤奶而获得的乳状分泌物。

优选地，乳底物获得自除了调节脂肪含量和/或水以外没有通过添加和/或去除乳成分在很大程度上改变组成的乳。

在一个实施例中，从这样的乳获得乳底物，该乳仅通过调节脂肪含量和/或水而改变组成。

脂肪含量和/或水的调节可能已经通过本领域已知的任何方法例如通过离心、蒸发、冷凝、超滤、纳米过滤、冷冻干燥、喷雾干燥、通过添加水进行重构等进行。

在一些实施例中，例如蛋白质含量或乳糖含量也可能已经通过例如乳制品公司略微调节，例如以获得具有明确定义的“标准”组成的乳底物。

乳底物可能已经进行了本领域已知的处理，例如巴氏灭菌、esl处理或uht处理。

优选地，乳底物是由乳产生的，而不改变乳清蛋白与酪蛋白的比率。优选地，乳清蛋白与酪蛋白的比率与乳中的相同。

在优选的实施例中，乳底物不包含添加的乳糖。在另一个优选的实施例中，例如通过添加/去除最初存在的乳糖的至多20％，优选至多10％，仅略微调节了乳糖含量。

在优选的实施例中，与最初存在的乳糖相比，乳底物中已经添加或去除至多20％，优选至多10％的乳糖。

在优选的实施例中，乳底物中没有添加或去除乳蛋白。在另一个优选的实施例中，例如通过添加/去除最初存在的乳蛋白的至多20％、优选至多10％，仅略微调节了乳底物中的乳蛋白含量。这意味着，除了因去除或添加脂肪或水而引起的相对变化外，总体乳蛋白含量与生乳中的总体乳蛋白含量在很大程度上相同。

在优选的实施例中，与最初存在的乳蛋白相比，乳底物中已经添加或去除至多20％、优选至多10％的乳蛋白。

优选地，乳底物比乳更浓。

在优选的实施例中，乳底物包含总量为至少10wt％的乳蛋白，如至少15wt％或至少20wt％的乳蛋白。

在优选的实施例中，乳底物是重构乳粉(如重构脱脂乳粉)或浓缩乳(如炼乳)。在更优选的实施例中，乳底物是重构乳粉，如重构脱脂乳粉。

在优选的实施例中，乳底物包含至少40wt％，优选至少45wt％、至少50wt％、至少55wt％、至少57wt％或至少60wt％的干物质。在另一个优选的实施例中，乳底物是包含至少40wt％、优选至少45wt％、至少50wt％、至少55wt％、至少57wt％或至少60wt％干物质的重构乳粉(如重构脱脂乳粉)或浓缩乳(如炼乳)。在另一个优选的实施例中，乳底物是包含至少40wt％、优选至少45wt％、至少50wt％、至少55wt％、至少57wt％或至少60wt％干物质的重构脱脂乳粉。

乳底物包含至少20wt％的乳糖。在优选的实施例中，乳底物包含至少25wt％，优选至少27wt％或至少30wt％的乳糖。

使乳底物与具有转半乳糖基活性的酶接触至少45分钟。在优选的实施例中，使乳底物与具有转半乳糖基活性的酶接触至少1小时，优选至少1.5小时、至少3小时、至少6小时、至少9小时、至少12小时、至少15小时、至少20小时或至少24小时。

在实施例中，使乳底物与具有转半乳糖基活性的酶在2℃-8℃、优选3℃-7℃的温度下接触12小时至5天，优选24小时至3天。

在另一个实施例中，使乳底物与具有转半乳糖基活性的酶在至少40℃、优选至少50℃、至少55℃或至少60℃的温度下，例如在40℃-65℃、50℃-65℃、55℃-65℃或60℃-65℃的温度下接触45分钟至48小时，优选2至36小时、更优选20至30小时。

在又另一个实施例中，使乳底物与具有转半乳糖基活性的酶在60℃-67℃的温度下接触45分钟至10小时，优选2小时-5小时。

优选地，以1-1,000lau(c)/g乳糖，优选5-500lau(c)/g乳糖、更优选8-150lau(c)/g乳糖的浓度添加具有转半乳糖基活性的酶。

可以通过直接测量从乳糖释放的葡萄糖来测定特定β-半乳糖苷酶的以lau(c)为单位的活性。技术人员了解如何确定这种活性。可替代地，可以通过使用在本申请的方法和实例中描述的活性测定来测定活性。在此，该活性可以通过将用已知活性的β-半乳糖苷酶运行的标准曲线与由此计算的未知样品的活性进行比较来获得。

当乳底物与转半乳糖基酶接触足够长的时间以确保足够的gos形成时，该酶将全部或部分失活。

可以通过将导致酶活性降低的本领域已知的任何方法(例如通过热处理、ph或蛋白酶)使酶失活。应当理解，失活可以是暂时的。失活可能由于乳产品的生产过程中的固有步骤(例如巴氏灭菌、esl处理、uht处理或喷雾干燥)而发生。

在一个优选的实施例中，通过热处理使酶完全或部分失活。

在乳底物与转半乳糖基酶接触后，可以通过本领域已知的方法(例如离心、均质化、巴氏灭菌、esl处理、uht处理或干燥(如喷雾干燥或冷冻干燥))进一步处理获得的乳产品。

在通过本发明的方法获得的乳产品中，总游离碳水化合物的至少35wt％必须是由于使乳底物与转半乳糖基酶接触而获得的原位产生的dp3+gos。

在优选的实施例中，总游离碳水化合物的至少40wt％是原位产生的dp3+gos。

在另一个优选的实施例中，总游离碳水化合物的35wt％-70wt％，优选40wt％-70wt％、更优选40wt％-60wt％或40wt％-50wt％是原位产生的dp3+gos。

在优选的实施例中，总游离碳水化合物的至少50wt％，优选至少55wt％或至少60wt％是原位产生的dp2+gos。

在另一个优选的实施例中，总游离碳水化合物的50wt％-80wt％，优选55wt％-80wt％或60wt％-80wt％、更优选50wt％-70wt％或60wt％-70wt％是原位产生的dp2+gos。

在优选的实施例中，通过本发明的方法产生的乳产品包含总量为至少11wt％、优选至少12wt％或至少13wt％的原位产生的dp3+gos。

在另一个优选的实施例中，通过本发明的方法获得的乳产品包含11wt％-20wt％、优选12wt％-20wt％或13wt％-20wt％、更优选11wt％-15wt％、12wt％-15wt％或13wt％-15wt％的原位产生的dp3+gos。

在优选的实施例中，通过本发明的方法获得的乳产品包含总量为至少12wt％、优选至少15wt％或至少18wt％的原位产生的dp2+gos。

在另一个优选的实施例中，通过本发明的方法获得的乳产品包含12wt％-25wt％、优选15wt％-25wt％或18wt％-25wt％、更优选12wt％-20wt％、15wt％-20wt％或18wt％-20wt％的原位产生的dp2+gos。

在优选的实施例中，通过本发明的方法获得的乳产品中的总游离碳水化合物的至多30wt％，优选至多20wt％，如至多15wt％或至多12wt％是乳糖。在另一个优选的实施例中，乳产品中总游离碳水化合物的0wt％-30wt％，优选0-20wt％，如0-15wt％或0-12wt％是乳糖。

在优选的实施例中，通过本发明的方法获得的乳产品是包含总量为至少11wt％、优选至少12wt％或至少13wt％的原位产生的dp3+gos的重构乳粉(如重构脱脂乳粉)或浓缩乳(如炼乳)。在另一个优选的实施例中，通过本发明的方法获得的乳产品是包含总量为11wt％-20wt％、优选12wt％-20wt％或13wt％-20wt％、更优选11wt％-15wt％、12wt％-15wt％或13wt％-15wt％的原位产生的dp3+gos的重构乳粉(如重构脱脂乳粉)或浓缩乳(如炼乳)。这种乳产品优选包含总量为至多10wt％，优选至多5wt％的乳糖。

在一个实施例中，本发明的方法还包括步骤(e)：

(e)干燥，优选喷雾干燥步骤(d)的乳产品以获得乳粉，如脱脂乳粉。

步骤(d)的乳产品或步骤(e)的乳粉可以用于产生例如蛋白质棒、乳饮品、婴儿配方食品或酸奶。

在一个实施例中，本发明的方法是用于产生发酵乳产品的方法，其包括：

(a)提供包含至少20％(w/v)乳糖的乳底物，

(b)使该乳底物与具有转半乳糖基活性的酶接触至少45分钟，

(c)在步骤(b)之前、期间和/或之后，优选通过与细菌培养物孵育来发酵乳底物，

(d)在步骤(c)之前或之后使酶失活，和

(e)由此获得发酵乳产品，其中总游离碳水化合物的至少35wt％是原位产生的dp3+低聚半乳糖(gos)。

在一个优选的实施例中，发酵的乳产品是酸奶。在另一个优选的实施例中，步骤(b)和步骤(c)是在37℃-45℃，优选约40℃-45℃、更优选约42℃-43℃的温度下进行。

具有转半乳糖基活性的酶

在本发明方法的方法中，使乳底物与具有转半乳糖基活性的酶接触。

来自糖苷水解酶家族2(gh2)的β-半乳糖苷酶是具有外切作用的酶，其水解β-d-半乳糖苷中的末端非还原性β-d-半乳糖残基，例如将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖。它们属于酶类别ec3.2.1.23，官方名称为β-d-半乳糖苷半乳糖水解酶。此酶的常用名称是乳糖酶，因为乳糖是常见的工业底物。除水解外，此酶类别还能够将半乳糖转移至其他糖类，从而制备低聚半乳糖(gos)。不同的gh2酶对水解或β-半乳糖苷酶活性和转半乳糖基酶活性具有不同的偏好，并且该偏好可以由其gos产生能力来表示，例如由转半乳糖基活性与水解活性的比率来表示。

在本上下文中，术语“β-半乳糖苷酶”意指具有将二糖乳糖水解成其成分半乳糖和葡萄糖单体的能力的任何糖苷水解酶。指定为亚类ec3.2.1.108的酶也称为乳糖酶，其在本发明的上下文中也被认为是β-半乳糖苷酶。在本发明的上下文中，该β-半乳糖苷酶的乳糖水解活性可以被称为其乳糖酶活性或其β-半乳糖苷酶活性。

在本发明的上下文中，具有转半乳糖基活性的酶优选属于酶类别3.2.1.23或ec3.2.1.108，优选3.2.1.23。具有转半乳糖基活性的酶优选属于糖苷水解酶家族2(gh2)，更优选属于糖苷水解酶家族gh2_5。

在某些应用中，可以考虑主要具有转半乳糖基活性和主要具有水解活性的多肽的组合。当需要在用具有β-半乳糖苷酶活性的多肽处理(例如在低乳糖水平下)后减少残留的乳糖时，这可能尤其有用。

当考虑在例如乳中的酶的反应时，碳水化合物最初以乳糖的形式存在，该乳糖是在乳中发现的由半乳糖和葡萄糖构成的二糖。在gos的形成中，连续的半乳糖分子被添加至乳糖中，然后在延长的孵育后，存在各种碳水化合物(葡萄糖、半乳糖和约30种不同的二糖和多糖)的混合物。

如本文所用的术语“二糖”意指通过称为糖苷键的共价键结合在一起的两个单糖单元，该糖苷键经由脱水反应形成，从而导致一个单糖失去氢原子而另一个单糖失去羟基基团。

如本文所用，术语“具有转半乳糖基活性的酶”、“转半乳糖基酶”和“转半乳糖基酶”可互换使用以意指能够将半乳糖转移至d-半乳糖(gal)或d-葡萄糖(glc)的羟基基团从而产生低聚半乳糖的酶。在一个实施例中，通过该酶对乳糖的反应来鉴定转半乳糖基酶活性，其中在给定时间产生的半乳糖的量少于产生的葡萄糖的量。

更特别地，可以将转半乳糖基酶活性(或对于用以水解乳糖或产生gos的酶的偏好)评价为在反应期间的任何给定时间产生的葡萄糖减去半乳糖的量，或者通过直接定量反应期间产生的gos来评价。可以通过包括本文实例中所示的方法在内的几种方式中的一种来进行此测量。

当评价酶的转半乳糖基活性与水解活性时，可以将水解活性测量为在反应期间的任何时间点产生的半乳糖浓度([gal])。

可以将转半乳糖基活性(即将半乳糖部分转移至除了水以外的分子)测量为在任何给定时间产生的([glc]-[gal])。

因此，在本发明的上下文中，将转半乳糖基活性与水解活性的比率确定为([glc]-[gal])/[gal]。

优选地，在本发明的方法中使用的具有转半乳糖基活性的酶是β-半乳糖苷酶，该β-半乳糖苷酶当使用13lau(c)/g乳糖的酶浓度在50℃下在60％的脱脂乳粉溶液中24小时后测量时，其转半乳糖基活性与水解活性的比率为至少1，优选至少2、至少3或至少4。

具有足够高的转半乳糖基活性的任何酶均可用于本发明的方法。酶的来源对于成功的结果并不重要。

本发明的方法中使用的具有转半乳糖基活性的酶可以是动物、植物或微生物来源的。优选的酶获得自微生物来源，特别是来自丝状真菌或酵母，或来自细菌。

该酶可以例如源自以下：蘑菇属(agaricus)的菌株，例如双孢蘑菇(a.bisporus)；ascovaginospora；曲霉属(aspergillus)，例如黑曲霉(a.niger)，泡盛曲霉(a.awamori)，臭曲霉(a.foetidus)，日本曲霉(a.japonicus)，米曲霉(a.oryzae)；念珠菌属(candida)；毛壳菌属(chaetomium)；chaetotomastia；网柄菌属(dictyostelium)，例如盘基网柄菌(d.discoideum)；克鲁维酵母属(kluveromyces)，例如脆壁克鲁维酵母(k.fragilis)、乳酸克鲁维酵母(k.lactis)；毛霉属(mucor)，例如爪哇毛霉(m.javanicus)、高大毛霉(m.mucedo)、细孢毛霉(m.subtilissimus)；脉孢菌属(neurospora)，例如粗糙脉孢菌(n.crassa)；根毛霉属(rhizomucor)，例如微小根毛霉(r.pusillus)；根霉属(rhizopus)，例如少根根霉(r.arrhizus)、日本根霉(r.japonicus)、匍枝根霉(r.stolonifer)；核盘霉属(sclerotinia)，例如白腐核盘霉(s.libertiana)；圆酵母属(torula)；球拟酵母属(torulopsis)；毛癣菌属(trichophyton)，例如红色毛癣菌(t.rubrum)；维氏核盘菌属(whetzelinia)，例如w.sclerotiorum；芽孢杆菌属(bacillus)，例如芽孢杆菌属的种凝结芽孢杆菌(b.coagulans)、环状芽孢杆菌(b.circulans)、巨大芽孢杆菌(b.megaterium)、b.novalis、枯草芽孢杆菌(b.subtilis)、短小芽孢杆菌(b.pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(b.stearothermophilus)、苏云金芽孢杆菌(b.thuringiensis)；双歧杆菌，例如动物双歧杆菌(b.animalis)、两歧双歧杆菌(b.bifidum)、短双歧杆菌(b.breve)、婴儿双歧杆菌(b.infantis)、乳双歧杆菌(b.lactis)、长双歧杆菌(b.longum)；金黄杆菌属(chryseobacterium)；柠檬酸杆菌属(citrobacter)，例如弗氏柠檬酸杆菌(c.freundii)；梭菌属(clostridium)，例如产气荚膜梭菌(c.perfringens)；色二孢属(diplodia)，例如棉色二孢(d.gossypina)；肠杆菌属(enterobacter)，例如产气肠杆菌(e.aerogenes)、阴沟肠杆菌(e.cloacae)；爱德华氏菌属(edwardsiella)、迟钝爱德华菌(e.tarda)；欧文氏菌属(erwinia)，例如草生欧文氏菌(e.herbicola)；埃希氏菌属(escherichia)，例如大肠杆菌；克雷伯氏菌属(klebsiella)，例如肺炎克雷伯氏菌(k.pneumoniae)；miriococcum；myrothesium；毛霉属；脉孢菌属(neurospora)，例如粗糙脉孢菌(n.crassa)；变形菌属(proteus)，例如普通变形菌(p.vulgaris)；普罗维登斯菌属(providencia)，例如斯氏普罗维登斯菌(p.stuartii)；密孔菌属(pycnoporus)，例如朱红密孔菌(pycnoporuscinnabarinus)、血红密孔菌(pycnoporussanguineus)；瘤胃球菌属(ruminococcus)，例如扭链瘤胃球菌(r.torques)；沙门氏菌属(salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(s.typhimurium)；沙雷氏菌属(serratia)，例如液化沙雷氏菌(s.liquefasciens)、粘质沙雷氏菌(s.marcescens)；志贺氏杆菌属(shigella)，例如弗氏志贺菌(s.flexneri)；链霉菌属(streptomyces)，例如抗生链霉菌(s.antibioticus)、栗色球孢链霉菌(s.castaneoglobisporus)、紫红链霉菌(s.violeceoruber)；栓菌属(trametes)；木霉属(trichoderma)，例如里氏木霉(t.reesei)、维里德木霉(t.viride)；耶尔森氏菌属(yersinia)，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(y.enterocolitica)。

在优选的实施例中，该酶是来自细菌，例如来自双歧杆菌科，如来自双歧杆菌属，如来自动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、乳双歧杆菌或长双歧杆菌菌株的β-半乳糖苷酶。在更优选的实施例中，该酶是来自两歧双歧杆菌的β-半乳糖苷酶。

在优选的实施例中，该酶是来自细菌，例如来自芽孢杆菌科，如来自芽孢杆菌属，如来自芽孢杆菌属的种凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、b.novalis、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌；双歧杆菌，例如动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、乳双歧杆菌、长双歧杆菌菌株的β-半乳糖苷酶。在更优选的实施例中，该酶是来自环状芽孢杆菌或婴儿芽孢杆菌的β-半乳糖苷酶。

优选的酶是具有如下序列的β-半乳糖苷酶，该序列与seqidno:1的氨基酸1-1304或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同。seqidno:1的这种片段可以是seqidno:1的具有转半乳糖基活性的任何片段。

在优选的实施例中，在本发明的方法中使用的具有转半乳糖基活性的酶具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与seqidno:1的氨基酸1-1304至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或100％相同并且具有900-1350个氨基酸，优选1300-1305个氨基酸、更优选1302或1304个氨基酸的长度。

在优选的实施例中，在本发明的方法中使用的具有转半乳糖基活性的酶包含与seqidno:2的氨基酸28-1931或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％相同的氨基酸序列。在更优选的实施例中，该酶包含与seqidno:2的氨基酸28-1931至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。

在另一个实施例中，本发明的方法中使用的具有转半乳糖基活性的酶具有与seqidno:3的氨基酸28-1331或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％相同的氨基酸序列。优选地，该多肽具有与seqidno:3的氨基酸28-1331至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。

在另一个实施例中，本发明方法中使用的具有转半乳糖基活性的酶具有与seqidno:4或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％相同的氨基酸序列。优选地，该多肽具有与seqidno:4至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。

在另一个实施例中，本发明方法中使用的具有转半乳糖基活性的酶具有与seqidno:5或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％相同的氨基酸序列。优选地，该多肽具有与seqidno:5至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。

在另一个实施例中，本发明方法中使用的具有转半乳糖基活性的酶具有与seqidno:6或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％相同的氨基酸序列。优选地，该多肽具有与seqidno:6至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。

在另一个实施例中，本发明方法中使用的具有转半乳糖基活性的酶具有与seqidno:7或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％相同的氨基酸序列。优选地，该多肽具有与seqidno:7至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。

在另一个实施例中，本发明方法中使用的具有转半乳糖基活性的酶具有与seqidno:8或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％相同的氨基酸序列。优选地，该多肽具有与seqidno:8至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。

在另一个实施例中，本发明方法中使用的具有转半乳糖基活性的酶具有与seqidno:9或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％相同的氨基酸序列。优选地，该多肽具有与seqidno:9至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。

在另一个实施例中，本发明方法中使用的具有转半乳糖基活性的酶具有与seqidno:10或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％相同的氨基酸序列。优选地，该多肽具有与seqidno:10至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。

在另一个实施例中，本发明方法中使用的具有转半乳糖基活性的酶具有与seqidno:11或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％相同的氨基酸序列。优选地，该多肽具有与seqidno:11至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。

在另一个实施例中，本发明方法中使用的具有转半乳糖基活性的酶具有与seqidno:12或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％相同的氨基酸序列。优选地，该多肽具有与seqidno:12至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。

在另一个实施例中，本发明方法中使用的具有转半乳糖基活性的酶具有与seqidno:13或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％相同的氨基酸序列。优选地，该多肽具有与seqidno:13至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。

在另一个实施例中，本发明方法中使用的具有转半乳糖基活性的酶具有与seqidno:14或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％相同的氨基酸序列。优选地，该多肽具有与seqidno:14至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。

在另一个实施例中，本发明方法中使用的具有转半乳糖基活性的酶具有与seqidno:15或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％相同的氨基酸序列。优选地，该多肽具有与seqidno:15至少60％，如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列。

出于本发明的目的，使用尼德曼-翁施算法(needleman-wunschalgorithm)(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性作为“最长同一性”的输出，该算法如emboss软件包(emboss：欧洲分子生物学开放软件套件(theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite)，rice等人，2000，trendsgenet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选6.6.0版本或更新版本)的尼德尔(needle)程序中所实施的。使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5以及eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩阵。为了使尼德尔程序报告最长同一性，必须在命令行中指定非简化(nobrief)选项。尼德尔标记的“最长同一性”的输出计算如下：

(相同的残基x100)/(比对长度-比对中的空位总数)

具有转半乳糖基活性的酶可以是胞外的。它可以在其n-末端具有信号序列，该信号序列在分泌过程中被切去。

具有转半乳糖基活性的酶可以源自本文提及的任何来源。术语“源自”在本发明的上下文中意指该酶可以从其天然存在的生物中分离，即该酶的氨基酸序列的身份(identity)与天然的多肽相同。术语“源自”还表示酶可以在宿主生物中重组产生，其中重组产生的酶具有与天然酶相同的身份，或具有修饰的氨基酸序列(例如具有缺失、插入和/或被取代的一个或多个氨基酸)，即重组产生的酶是天然氨基酸序列的突变体和/或片段。天然的酶的含义中包括天然的变体。此外，术语“源自”包括通过例如肽合成而合成产生的酶。术语“源自”还包括已经通过例如糖基化、磷酸化等在体内或体外修饰的酶。对于重组产生的酶，术语“源自”指酶的身份而不是重组产生酶的宿主生物的身份。

可以通过使用任何合适的技术从微生物获得具有转半乳糖基活性的酶。例如，酶制剂可通过发酵合适的微生物和之后通过本领域公知的方法从所得的发酵液或微生物分离乳糖酶制剂而获得。具有转半乳糖基活性的酶还可以通过使用重组dna技术而获得。这种方法通常包括培养用重组dna载体转化的宿主细胞，该载体包含编码所讨论的乳糖酶的dna序列，并且dna序列与合适的表达信号可操作地连接，使其能在允许酶表达的条件下在培养基中表达酶，并从培养物回收酶。还可以将dna序列掺入宿主细胞的基因组中。dna序列可以是基因组、cdna或合成来源的、或它们的任何组合，并且可以按照本领域已知的方法进行分离或合成。

具有转半乳糖基活性的酶可以是经纯化的。如本文使用的术语“纯化的”包括基本上不含来自生产生物的不溶组分的β-半乳糖苷酶蛋白。术语“纯化的”还包括基本上不含来自获得酶的天然生物的不溶组分的β-半乳糖苷酶蛋白。优选地，还可以从酶的来源生物和培养基的一些可溶组分分离。更优选地，可以通过一种或多种单元操作来进行分离：过滤、沉淀或色谱。

因此，可纯化具有转半乳糖基活性的酶，即仅存在少量的其他蛋白质。表述“其他蛋白质”具体涉及其他酶。如本文使用的术语“纯化的”还指代去除其他组分，特别是存在于β-半乳糖苷酶的来源细胞中的其他蛋白质以及最特别是存在于β-半乳糖苷酶的来源细胞中的其他酶。具有转半乳糖基活性的酶可以是“基本上纯的”，即不含来自产生酶的生物(即，例如用于重组产生β-半乳糖苷酶的宿主生物)的其他成分。优选地，具有转半乳糖基活性的酶是至少40％(w/w)纯，更优选至少50％、60％、70％、80％或者甚至至少90％纯的酶蛋白制剂。

术语具有转半乳糖基活性的酶包括酶的催化活性必需的任何辅助化合物，如，例如合适的受体或辅因子，其可以或者可以不天然存在于反应系统中。

酶可以是适合于所述用途的任何形式，如，例如，为干粉或颗粒、无尘颗粒、液体、稳定化液体或受保护酶的形式。

糖化

尽管某些β-半乳糖苷酶或乳糖酶具有主要的水解特性，但是这些酶可以例如通过对酶进行预孵育而转化为具有更高的转移特性。因此，预孵育导致了更稳健的产生gos的酶，这是由于该酶更高的转移能力(转半乳糖基化酶活性)所致。

不希望受理论的束缚，认为这些孵育条件导致β-半乳糖苷酶的糖化，这导致增加的转移特性。随着糖部分的共价附接，β-半乳糖苷酶从水解酶转化为具有转半乳糖基酶活性的转移酶。

在实施例中，具有转半乳糖基活性的酶已通过糖化而被修饰。

如本文所用的“糖化”是指碳水化合物共价附接至蛋白质。碳水化合物附接可以是经由例如该酶的精氨酸、赖氨酸或n-末端的侧链。优选地，该碳水化合物附接是经由精氨酸或赖氨酸的侧链。

糖化有时被称为(非酶促)糖基化。在本发明的上下文中，糖基化和糖化可互换使用，并且糖基化可以是非酶促的。

在实施例中，具有转半乳糖基活性的酶已通过该酶的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60个残基的糖化而被修饰。

在实施例中，具有转半乳糖基活性的酶已通过该酶的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60个赖氨酸和/或精氨酸残基的糖化而被修饰。

在实施例中，具有转半乳糖基活性的酶已通过该酶的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的赖氨酸和/或精氨酸残基的糖化而被修饰。在一个实施例中，具有转半乳糖基活性的酶已通过该酶的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60个赖氨酸和/或精氨酸残基的糖化而被修饰。

在实施例中，在如下文详述的合适条件下孵育导致赖氨酸和/或精氨酸的一些、基本上所有或甚至所有表面残基的糖化。同样，不希望受理论的束缚，认为一些、基本上所有或甚至所有糖化残基位于具有转半乳糖基活性的酶的c-末端。

在实施例中，具有转半乳糖基活性的酶已经与5wt％-90wt％糖的溶液在ph5-10下，在20℃-80℃的温度下接触3-20小时的时间。优选的糖是还原糖，并且特别优选葡萄糖。

在优选的实施例中，将具有转半乳糖基活性的酶与40wt％-70wt％，优选50wt％-70wt％或55wt％-65wt％的葡萄糖在40℃-60℃、优选50℃-60℃下孵育40-100小时、优选50-90或60-80小时。

示例性的还原糖包括单糖果糖、半乳糖、葡萄糖、甘油醛、核糖、木糖。优选果糖、半乳糖和/或葡萄糖，并且最特别地是果糖和/或葡萄糖。

其他示例性还原糖包括二糖，如纤维二糖、乳糖和麦芽糖，优选乳糖和/或麦芽糖。示例还有葡萄糖聚合物例如麦芽糖糊精和糖原。

还原糖的存在可以通过许多熟知的测试，包括使用benedict试剂和/或tollen试剂来检测。

优选实施例

1.一种用于产生乳产品的方法，其包括：

(a)提供包含至少20wt％乳糖的乳底物，

(b)使该乳底物与具有转半乳糖基活性的酶接触至少45分钟，

(c)使该酶完全或部分失活，和

(d)由此获得乳产品，其中总游离碳水化合物的至少35wt％是原位产生的dp3+低聚半乳糖(gos)。

2.如实施例1所述的方法，其中该游离碳水化合物是未与蛋白质共价结合的碳水化合物。

3.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该dp3+gos是聚合度为至少3的gos。

4.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该乳底物是重构乳粉如重构脱脂乳粉，或浓缩乳如炼乳。

5.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该乳底物是重构乳粉，如重构脱脂乳粉。

6.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该乳底物获得自除了调节脂肪含量和/或水以外没有通过添加和/或去除乳成分在很大程度上改变组成的乳。

7.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该乳底物中乳清蛋白与酪蛋白的比率与乳中的相同。

8.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该乳底物是由乳产生的，而不改变乳清蛋白与酪蛋白的比率。

9.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该乳底物不包含添加的乳糖。

10.如前述实施例中任一项所述的方法，其中与最初存在的乳蛋白相比，该乳底物中已经添加或去除至多20％、优选至多10％的乳蛋白。

11.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该乳底物包含至少40wt％，优选至少45wt％、至少50wt％或至少55wt％，更优选至少57wt％或至少60wt％的干物质。

12.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该乳底物包含至少25wt％，优选至少27wt％或至少30wt％的乳糖。

13.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该乳产品中总游离碳水化合物的至少40wt％是原位产生的dp3+gos。

14.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该乳产品中总游离碳水化合物的至少50wt％，优选至少55wt％、至少57wt％或至少60wt％是原位产生的dp2+gos。

15.如前述实施例中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中至少35wt％，优选至少40wt％的乳糖转化为dp3+gos。

16.如前述实施例中任一项所述的方法，其中在步骤(b)中至少50wt％，优选至少55wt％、至少57wt％或至少60wt％的乳糖转化为dp2+gos。

17.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该乳产品中总游离碳水化合物的至多30wt％，优选至多20wt％，如至多15wt％或至多12wt％是乳糖。

18.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该乳产品是包含总量为至多10wt％、优选至多5wt％的乳糖的重构乳粉如重构脱脂乳粉，或浓缩乳如炼乳。

19.如前述实施例中任一项所述的方法，其中使该乳底物与具有转半乳糖基活性的酶接触至少1小时，优选至少1.5小时、至少3小时、至少6小时、至少9小时、至少12小时、至少15小时、至少20小时或至少24小时。

20.如前述实施例中任一项所述的方法，其中使该乳底物与具有转半乳糖基活性的酶在2℃-8℃、优选3℃-7℃的温度下接触12小时至5天，优选24小时至3天。

21.如实施例1-18中任一项所述的方法，其中使该乳底物与具有转半乳糖基活性的酶在至少40℃、优选至少50℃、至少55℃或至少60℃的温度下接触45分钟至48小时，优选2-36小时、更优选20-30小时。

22.如实施例1-18中任一项所述的方法，其中使该乳底物与具有转半乳糖基活性的酶在60℃-67℃的温度下接触45分钟至10小时，优选2小时-5小时。

23.如前述实施例中任一项所述的方法，其中以1-1,000lau(c)/g乳糖，优选5-500lau(c)/g乳糖的浓度添加该具有转半乳糖基活性的酶。

24.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该具有转半乳糖基活性的酶具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与seqidno:1的氨基酸1-1304或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与seqidno:2的氨基酸28-1931或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与seqidno:3的氨基酸28-1331或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与seqidno:4或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与seqidno:5或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与seqidno:6或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与seqidno:7或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与seqidno:8或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与seqidno:9或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与seqidno:10或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与seqidno:11或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与seqidno:12或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与seqidno:13或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；与seqidno:14或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同；或与seqidno:15或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％，如至少60％、如至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同。

25.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该具有转半乳糖基活性的酶具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与seqidno:1的氨基酸1-1304或其具有转半乳糖基活性的片段至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或100％相同。

26.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该具有转半乳糖基活性的酶具有如下氨基酸序列，该氨基酸序列与seqidno:1的氨基酸1-1304至少50％，如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或100％相同并且具有900-1350个氨基酸，优选1300-1305个氨基酸、更优选1302或1304个氨基酸的长度。

27.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该具有转半乳糖基活性的酶已经通过至少一个赖氨酸和/或精氨酸残基的糖化而被修饰。

28.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该具有转半乳糖基活性的酶已经与还原糖，优选果糖、葡萄糖、半乳糖或乳糖接触，接触的时间和温度足以产生通过糖化修饰的多肽。

29.如前述实施例中任一项所述的方法，其中与未通过糖化修饰的酶相比，该已通过糖化修饰的具有转半乳糖基活性的酶具有改进的转半乳糖基活性。

30.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该具有转半乳糖基活性的酶已经通过与30wt％-90wt％的还原糖，优选果糖、葡萄糖或半乳糖在ph5-8下在20℃-80℃的温度下接触3-20小时的时间进行糖化而被修饰。

31.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该具有转半乳糖基活性的酶已经与40wt％-70wt％，优选50wt％-70wt％或55wt％-65wt％的葡萄糖在40℃-60℃、优选50℃-60℃下孵育40-100小时、优选50-90或60-80小时。

32.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该具有转半乳糖基活性的酶已经通过与至少40wt％，优选至少60wt％或至少80wt％的还原糖，优选葡萄糖接触进行糖化而被修饰。

33.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该具有转半乳糖基活性的酶是β-半乳糖苷酶，该β-半乳糖苷酶当使用13lau(c)/g乳糖的酶浓度在50℃下在60％的脱脂乳粉溶液中24小时后测量时，其转半乳糖基活性与水解活性的比率为至少1，优选至少2、至少3或至少4。

34.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该具有转半乳糖基活性的酶是属于酶类别ec3.2.1.23或3.2.1.108，优选3.2.1.23的β-半乳糖苷酶。

35.如前述实施例中任一项所述的方法，其中该具有转半乳糖基活性的酶是gh2β-半乳糖苷酶，优选gh2_5β-半乳糖苷酶。

36.如前述实施例中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中通过热处理使该酶完全或部分失活。

37.如前述实施例中任一项所述的方法，其中在步骤(c)中通过巴氏灭菌、esl处理、uht处理或喷雾干燥使该酶完全或部分失活。

38.如前述实施例中任一项所述的方法，其还包括：

(e)干燥，优选喷雾干燥步骤(d)的乳产品以获得乳粉，如脱脂乳粉。

39.如前述实施例中任一项所述的方法，其还包括：

(e)任选地干燥、优选喷雾干燥步骤(d)的乳产品以获得粉，如脱脂乳粉，和

(f)在蛋白棒的产生中使用步骤(d)的乳产品或步骤(e)的乳粉。

40.如前述实施例中任一项所述的方法，其还包括：

(e)任选地干燥、优选喷雾干燥步骤(d)的乳产品以获得粉，如脱脂乳粉，和

(f)在乳饮品的产生中使用步骤(d)的乳产品或步骤(e)的乳粉。

41.如前述实施例中任一项所述的方法，其还包括：

(e)任选地干燥、优选喷雾干燥步骤(d)的乳产品以获得粉，如脱脂乳粉，和

(f)在婴儿配方食品的产生中使用步骤(d)的乳产品或步骤(e)的乳粉。

42.如前述实施例中任一项所述的方法，其还包括：

(e)任选地干燥、优选喷雾干燥步骤(d)的乳产品以获得粉，如脱脂乳粉，和

(f)在酸奶的产生中使用步骤(d)的乳产品或步骤(e)的乳粉。

43.如实施例1-37中任一项所述的方法，其是用于产生发酵乳产品的方法，该方法包括：

(a)提供包含至少20％(w/v)乳糖的乳底物，

(b)使该乳底物与具有转半乳糖基活性的酶接触至少45分钟，

(c)在步骤(b)之前、期间和/或之后，优选通过与细菌培养物孵育来发酵该乳底物，

(d)在步骤(c)之前或之后使该酶失活，和

(e)由此获得发酵乳产品，其中总游离碳水化合物的至少35wt％是原位产生的dp3+低聚半乳糖(gos)。

44.如实施例43所述的方法，其中该发酵乳产品是酸奶。

45.如实施例43-44中任一项所述的方法，其中步骤(b)和步骤(c)在40℃-45℃的温度下进行。

46.一种可通过前述实施例中任一项的方法获得的乳产品。

47.一种乳产品，其包含总量为至少11wt％的原位产生的dp3+低聚半乳糖(gos)，并且其中该原位产生的dp3+gos构成总游离碳水化合物的至少35wt％。

48.如实施例47所述的乳产品，其中该游离碳水化合物是未与蛋白质共价结合的碳水化合物。

49.如实施例47-48中任一项所述的乳产品，其中该dp3+gos是聚合度为至少3的gos。

50.如实施例47-49中任一项所述的乳产品，其是重构乳粉如重构脱脂乳粉，浓缩乳如炼乳，或乳粉如脱脂乳粉。

51.如实施例47-50中任一项所述的乳产品，其包含至少40wt％，优选至少45wt％、至少50wt％、至少55wt％、至少57wt％或至少60wt％的干物质。

52.如实施例47-51中任一项所述的乳产品，其获得自除了调节脂肪含量和/或水以外没有通过添加和/或去除乳成分在很大程度上改变组成的乳。

53.如实施例47-52中任一项所述的乳产品，其中乳清蛋白与酪蛋白的比率与乳中的相同。

54.如实施例47-53中任一项所述的乳产品，其是由乳产生的，而没有改变乳清蛋白与酪蛋白的比率。

55.如实施例47-54中任一项所述的乳产品，其不包含添加的乳糖。

56.如实施例47-55中任一项所述的乳产品，其包含总量为至少10wt％的乳蛋白，如至少15wt％或至少20wt％的乳蛋白。

57.如实施例47-56中任一项所述的乳产品，其是脱脂乳粉或重构脱脂乳粉。

58.如实施例47-57中任一项所述的乳产品，其中该总游离碳水化合物的至少40wt％是原位产生的dp3+gos。

59.如实施例47-58中任一项所述的乳产品，其中该总游离碳水化合物的至少50wt％，优选至少55wt％或至少60wt％是原位产生的dp2+gos。

60.如实施例47-59中任一项所述的乳产品，其包含总量为至少12wt％、优选至少13wt％的原位产生的dp3+gos。

61.如实施例47-60中任一项所述的乳产品，其包含总量为至少12wt％、优选至少15wt％或至少18wt％的原位产生的dp2+gos。

62.如实施例47-61中任一项所述的乳产品，其中该乳产品中总游离碳水化合物的至多30wt％，优选至多20wt％，如至多15wt％或至多12wt％是乳糖。

63.如实施例47-62中任一项所述的乳产品，其是包含总量为至少11wt％、优选至少12wt％或至少13wt％的原位产生的dp3+gos的重构乳粉如重构脱脂乳粉，或浓缩乳如炼乳。

64.如实施例63所述的乳产品，其包含总量为至多10wt％，优选至多5wt％的乳糖。

65.如实施例47-62中任一项所述的乳产品，其是包含总量为至少11wt％、优选至少12wt％或至少13wt％的原位产生的dp3+gos的乳粉，如脱脂乳粉。

66.如实施例65所述的乳粉，其包含总量为至少15wt％、优选至少18wt％或至少20wt％的原位产生的dp3+gos。

67.如实施例65-66中任一项所述的乳粉，其包含总量为至多15wt％，优选至多10wt％的乳糖。

实例

材料和方法

活性测定(lau(c))

原理：

乳糖酶水解乳糖以形成α-d-葡萄糖。在己糖激酶催化的反应中，α-d-葡萄糖被atp磷酸化。形成的葡萄糖-6-磷酸被葡萄糖-6-磷酸脱氢酶氧化成6-磷酸葡萄糖酸。伴随着该反应，等摩尔量的nad+被还原成nadh，导致在340nm处的吸光度增加。

试剂：

15％(w/v)brijl23：称量508.0±0.4g的l23(sigmab4184)放入烧杯中。添加约300ml超纯水并搅拌。将l23定量转移至1l容量瓶中。用超纯水填充至刻度。搅拌至均匀。可储存性：在冰箱中2个月。

显色试剂：(葡萄糖试剂盒(ghk)(0.1mtris、2.1mmatp、2.1mmnad、4mmmg2+、<0.1％nan3、4mmmg2+、>7.5ku/l己糖激酶、>7.5ku/lg-6-p-dh，ph7.8))：打开葡萄糖(hk)试剂a的小瓶(thermofisherscientific(产品编号：981304或981779))和葡萄糖(hk)试剂b的小瓶(thermofisherscientific(产品编号：981304或981779))。将1瓶试剂b倒入1瓶试剂a中。盖上盖子。通过缓慢地且温和地上下旋转小瓶10-15次充分混合。使用在试剂a小瓶中的全部混合物，或将所需量倒入适当的容器中。可储存性：在冰箱中1个月。

溶解缓冲液/稀释缓冲液(0.01m柠檬酸一水合物、0.0225％(w/v)l23、1mmmgso4,7h2o，ph4.5)：称量21.0±0.1g柠檬酸一水合物(cas号5949-29-1)并将其定量转移至10l容量瓶中。称量2.46±0.01g的mgso4,7h2o(cas号10034-99-8)并定量转移至容量瓶中。添加约9l的脱矿质水并搅拌直至完全溶解。将15ml的15％(w/v)brijl23添加至容量瓶中并搅拌。添加约35ml的4mnaoh(cas号1310-73-2)并搅拌。根据情况使用例如4mnaoh或例如hcl将ph调节至4.50±0.05。用脱矿质水填充至刻度并搅拌。可储存性：在室温下13天。

底物(31.6％w/w乳糖一水合物、0.01m柠檬酸一水合物、0.0225(w/v)brijl23、1mmmgso4,7h2o)：称量7.9±0.2g乳糖一水合物(cas号10039-26-6)，直接放入烧杯中。溶解至总体积为25.0±0.1g的溶解缓冲液。加热并搅拌直至完全溶解，而底物不沸腾。可储存性：在室温下6小时。

标准品：使用具有鉴定的lau(c)/g的酶标准品(可从丹麦的诺维信公司(novozymesa/s)获得)作为标准品，在溶解缓冲液中稀释至0.197-0.7880lau(c)/ml的范围内。

程序：

1.将50ul的底物在50℃下孵育540秒。减去空白(50ul的溶解缓冲液)。

2.添加25ul在溶解缓冲液中的样品。

3.将反应孵育1800秒，然后添加160ul显色试剂。

4.300秒后，测量在340nm处的吸光度。

酶活性的计算：

从标准曲线读取稀释样品的酶活性。以lau(c)/g为单位的样品活性的计算如下式所述：

s＝从标准曲线的读取，以lau(c)/ml为单位

v＝使用的容量瓶的体积，以ml为单位

f＝第二次稀释的稀释度

w＝样品的重量，以g为单位实例1

样品：

具有如seqidno:1所示序列的两歧双歧杆菌β-半乳糖苷酶已在地衣芽孢杆菌中表达，并使用uf(截断值为10kda)浓缩，最终用60％(w/w)葡萄糖配制，并在55℃下孵育69.5h，然后在-20℃下储存。此样品的浓度为5300lau(c)/g。

常规乳中的gos生产。

在5℃下24h(结果显示在表1中)。

将两毫升半脱脂乳(阿拉公司，在丹麦当地一家超市中购买，每100g含有4.7g乳糖和3,5g蛋白质)转移到5mleppendorf管中(对每个剂量(包括对照)进行两次测定)。然后添加20μl酶稀释物(最终lau(c)/l可参见表1)并混合，然后在5℃下孵育24h。孵育后，将10μl浓乙酸添加至每个样品中，并将溶液加热至90℃保持5min。失活后，将样品在室温下以14,000rpm离心5min。将1ml上清液转移至另一个管中，并保持冷冻直至通过hplc分析。

在60℃下3h(结果显示在表3中)

将两毫升半脱脂乳(阿拉公司，在丹麦当地一家超市中购买，每100g含有4.7g乳糖和3.5g蛋白质)转移到2mleppendorf管中(对每个剂量(包括对照)进行两次测定)。然后添加20μl酶稀释物(最终lau(c)/l可参见表3)并混合，然后在60℃下孵育3h。孵育后，将10μl浓乙酸添加至每个样品中，并将溶液加热至90℃保持5min。失活后，将样品在室温下以14,000rpm离心5min。将1ml上清液转移至另一个管中，并保持冷冻直至通过hplc分析。

在60％脱脂乳粉溶液(smp)中的gos生产

在5℃下22.5h(结果显示在表2中)

将12g脱脂乳粉(含有50％乳糖和35％蛋白质)和8ml样品溶液(最终lau(c)/kg60％smp可参见表2)添加至50ml试管中，混合并在5℃下孵育22.5h。随后添加20ml3％hac并用抹刀混合直至溶液均匀，然后在室温下置于旋转器上10min。然后以7850rpm离心10min，将200μl上清液转移至含有1ml水的2mleppendorf管中，加热至90℃保持5min，在室温下以14,000rpm离心5min，并将上清液保持冷冻状态直到用于两次分析型hplc测试。

在50℃、55℃和60℃下24h并且在65℃下3h(结果显示在表4中)

将12g脱脂乳粉(含有50％乳糖和35％蛋白质)和8ml样品溶液(最终lau(c)/kg60％smp可参见表4)添加至50ml试管中，混合并在50℃、55℃或60℃下孵育24h或在65℃下孵育3h。随后添加20ml3％hac并用抹刀混合直至溶液均匀，然后在室温下置于旋转器上10min。然后以7850rpm离心10min，将200μl上清液转移至含有1ml水的2mleppendorf管中，加热至90℃保持5min，在室温下以14,000rpm离心5min，并将上清液保持冷冻状态直到用于两次分析型hplc测试。

测定乳糖(lac)和gos二糖(dp2-gos)的比率

如下进行使用pa1柱的带有脉冲安培检测的高效阴离子交换色谱(hpaec-pad)，以定量测定半乳糖(gal)、葡萄糖(glc)、乳糖(lac)和dp2-gos。

将50μl样品与500μlmilliq水+10μlcarrezi溶液在5mleppendorf管中混合，然后与10μlcarrezii溶液混合。然后添加4.43mlmilliq水，并在室温下以14,000rpm离心5min。将1ml上清液与4mlmilli-q水混合，并转移到spin-x过滤管中，并以6,000rpm离心5min，并施加在pa1柱上。定量测定lac、b-1-6-gal-gal、b-1-6-gal-glc、b-1-3-gal-gal、b-1-4-gal-gal和b-1-3-gal-glc(+b-1-2-gal-glc)，从而可以测定gos二糖(dp2g)和乳糖的比率。

随后使用此dp2g/(lac+dp2g)比率来计算通过dionexhplc系统ics-5000ri方法测定的dp2峰中dp2g的量(参见下文)，然后可以通过dp3+和dp2g的总和计算总gos。

同样，lac/(lac+dp2g)比率(＝1减去dp2g/(lac+dp2g))可用于计算以下测定的dp2峰中的乳糖量。

定量测定glc、gal、dp2、dp3、dp4和dp5+

dionexhplc系统ics-5000ri(aminex-hpx-87h离子排斥柱)用于定量测定gal、glc、dp2、dp3、dp4和dp5+。将未稀释的样品转移至spin-x过滤管中，并以6,000rpm离心5min，然后施加至aminex-hpx-87h柱。在与酶处理的样品相同的条件下孵育未添加酶的对照样品，并使用该对照样品计算来自酶处理的gal、glc和dp3、dp4和dp5+的贡献。

表中显示的数字是基于gal、glc、dp3、dp4和dp5+的定量测定减去在对照(无酶)样品中估算的gal、glc、dp3、dp4和dp5+的定量的量。

将定量dp3+测定为dp3+dp4+dp5+。

定量测定gos二糖(dp2-gos)和乳糖(lac)

定量乳糖(lac)＝dp2乘以上文测定的lac/(lac+dp2g)比率。

定量dp2g＝dp2乘以上文测定的dp2g/(lac+dp2g)比率。

最后，定量gos＝dp2g加dp3+。

结果

表1.5℃下在常规乳中持续24h的gos生产

表2.5℃下在60％smp中持续22.5h的gos生产

为了声明在乳制品中的纤维，要求有高dp3+(dp3+是dp3和更高的dp，根据纤维定义)。如表1所见，如果起始底物是常规乳，则最多可获得28.0％dp3+；而60％smp则最多可获得38.7％，参见表2。通过60％smp应用能够获得更高的dp3+产量，除了纤维声明之外，最终乳产品的卡路里也更低，因为dp3+具有2kcal/g，而glc、gal和dp2g具有4kcal/g，如欧盟监管(euregulatory)所述：附件十四，关于向消费者提供食品信息的条例1169/2011。

表3.60℃下在常规乳中持续3h的gos生产

表4.50℃、55℃和60℃下在60％smp中持续24h和65℃下持续3h的gos生产

表3显示了60℃下在常规乳中持续3h随渐增的酶剂量(lau(c)/kg，第1列)而制得的gos。在最高酶剂量下，获得了31.3％的dp3+，这比在5℃下获得的最大dp3+高3.3％(参见表1)。与5℃下60％smp(表2)相比，观察到在高温(50℃-65℃，表4)下60％smp中dp3+的相对增加相同。因此，在常规乳和60％smp中，较高温度下均可获得dp3+的相对增加。

表4显示，有可能获得这样的重构脱脂乳粉(60％)，其中超过44wt％的总游离碳水化合物是原位产生的dp3+gos。所使用的脱脂乳粉含有50％乳糖。因此，在重构脱脂乳粉中原位产生的dp3+gos的总量大于13wt％(44％x60％x50％)。如果将获得的重构脱脂乳粉干燥，例如通过喷雾干燥，则获得的脱脂乳粉将包含超过22wt％的原位产生的dp3+gos(44％x50％)。

本文描述和要求保护的本发明不限于本文公开的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。任何等同方面旨在处于本发明的范围之内。实际上，除了本文所示和描述的那些之外，本发明的各种修改对于本领域的技术人员会从前述说明变得清楚。此类修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在冲突的情况下，以包括定义的本公开为准。

序列表

<110>诺维信公司（novozymesa/s）

tams,jeppewegener

<120>乳制品

<130>14709-wo-pct

<160>15

<170>patentin3.5版

<210>1

<211>1304

<212>prt

<213>人工序列

<220>

<223>合成构建体

<400>1

valgluaspalathrargseraspserthrthrglnmetserserthr

151015

progluvalvaltyrserseralavalaspserlysglnasnargthr

202530

serasppheaspalaasntrplysphemetleuseraspservalgln

354045

alaglnaspproalapheaspaspseralatrpglnglnvalaspleu

505560

prohisasptyrserilethrglnlystyrserglnserasngluala

65707580

gluseralatyrleuproglyglythrglytrptyrarglysserphe

859095

thrileaspargaspleualaglylysargilealaileasnpheasp

100105110

glyvaltyrmetasnalathrvaltrppheasnglyvallysleugly

115120125

thrhisprotyrglytyrserpropheserpheaspleuthrglyasn

130135140

alalyspheglyglygluasnthrilevalvallysvalgluasnarg

145150155160

leuproserserargtrptyrserglyserglyiletyrargaspval

165170175

thrleuthrvalthraspglyvalhisvalglyasnasnglyvalala

180185190

ilelysthrproserleualathrglnasnglyglyasnvalthrmet

195200205

asnleuthrthrlysvalalaasnaspthrlysalaalaalaasnile

210215220

thrleulysglnthrvalpheprolysglyglylysthraspalaala

225230235240

ileglythrvalthrthralaserlysserilealaalaglyalaser

245250255

alaaspvalthrserthrilethralaalaserprolysleutrpser

260265270

ilelysasnproasnleutyrthrvalargthrgluvalleuasngly

275280285

glylysvalleuaspthrtyraspthrglutyrglypheargtrpthr

290295300

glypheaspalathrserglypheserleuasnglyglulysvallys

305310315320

leulysglyvalsermethishisaspglnglyserleuglyalaval

325330335

alaasnargargalailegluargglnvalgluileleuglnlysmet

340345350

glyvalasnserileargthrthrhisasnproalaalalysalaleu

355360365

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370375380

aspmettrpasnargserlysasnglyasnthrgluasptyrglylys

385390395400

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405410415

lysaspgluthrtrpalalyspheaspleuthrserthrileasnarg

420425430

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435440445

metgluglyileserglyservalserglypheproalathrserala

450455460

lysleuvalalatrpthrlysalaalaaspserthrargprometthr

465470475480

tyrglyaspasnlysilelysalaasntrpasngluserasnthrmet

485490495

glyaspasnleuthralaasnglyglyvalvalglythrasntyrser

500505510

aspglyalaasntyrasplysileargthrthrhisprosertrpala

515520525

iletyrglysergluthralaseralaileasnserargglyiletyr

530535540

asnargthrthrglyglyalaglnserserasplysglnleuthrser

545550555560

tyraspasnseralavalglytrpglyalavalalaserseralatrp

565570575

tyraspvalvalglnargaspphevalalaglythrtyrvaltrpthr

580585590

glypheasptyrleuglygluprothrprotrpasnglythrglyser

595600605

glyalavalglysertrpproserprolysasnsertyrpheglyile

610615620

valaspthralaglypheprolysaspthrtyrtyrphetyrglnser

625630635640

glntrpasnaspaspvalhisthrleuhisileleuproalatrpasn

645650655

gluasnvalvalalalysglyserglyasnasnvalprovalvalval

660665670

tyrthraspalaalalysvallysleutyrphethrprolysglyser

675680685

thrglulysargleuileglyglulysserphethrlyslysthrthr

690695700

alaalaglytyrthrtyrglnvaltyrgluglyalaasplysaspser

705710715720

thralahislysasnmettyrleuthrtrpasnvalprotrpalaglu

725730735

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740745750

gluglyserthrgluglyasnalaservalthrthrthrglylysala

755760765

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770775780

lysaspleusertyrilegluvalaspvalthraspalaasnglyhis

785790795800

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805810815

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850855860

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865870875880

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885890895

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900905910

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glythrvalalaglyglnlysileservalargvalthrmetileasp

945950955960

gluileglyalaleuleuasntyrseralaserthrprovalglythr

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proalavalleuproglyserargproalavalleuproaspglythr

980985990

valthrseralaasnphealavalasptrpthrlysproalaaspthr

99510001005

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101010151020

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102510301035

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165516601665

alavalglygluleualaargalaalacyshishisvalilegly

167016751680

leuargvalaspthrhisargleulysalaserglypheglnile

168516901695

proalaaspaspmetalagluileaspargilethrglyphehis

170017051710

argphegluarghisvalgly

17151720

<210>13

<211>1396

<212>prt

<213>环状芽孢杆菌

<400>13

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151015

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202530

trpargglnleuserleuprohisasptrpserilegluleuaspphe

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505560

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lysargileserleuasppheaspglyvaltyrmetasnserthrthr

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100105110

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115120125

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130135140

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asnprovalserproglupheleuglualavalasnasnleuglyleu

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tyrasptyrglyargphephethrargtrpalagluhisaspvallys

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alaargasnleuvalargtrpilelysgluileaspthrthrargpro

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435440445

proileaspproasnileleugluilephehisthrvalaspvalval

450455460

glyleuasntyrsergluasnasntyrvalglytyrhisgluglnhis

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proasntrplysleutyrglysergluthrserseralathrargser

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argglyvaltyrthrhisprotyrglutyrasnleuglythrlystyr

500505510

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protyrtyraspsertyrproalalyssersertyrpheglyalaval

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aspthralaglypheprolysaspilephetyrtyrtyrglnsergln

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trplyslysgluprometvalhisleuleuprohistrpasntrpthr

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thrtyrleuglutrpalavalprophelysalaglythrleugluala

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ilelysalaaspglythraspleuserpheilethralagluileval

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aspserlysglyasnvalvalproasnalaasphisleuileglnphe

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hisleuserglyhisglygluleualaglyvalaspasnglyaspala

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alaservalgluargtyrlysaspasnlysarglysalaphesergly

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lysalaleualailevalglnserasnlysleuaspglyasnilethr

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leuhisalaseralagluglyleuserserglyasnvalthrilephe

785790795800

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gluvalasnvalleuvalasppheasnvalvalprogluleuproser

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thrtrpaspalavalaspproasnleuleuasnthralaglylysile

850855860

ilevalgluglythrvalgluglythrasplyslysalalysalaleu

865870875880

leuilevallysglyasnglyglngluasnserglutyrargileasp

885890895

leupheserproaspprolysleuileserthrgluleuthrvalglu

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lysthrasnilemetgluaspasppheileaspilelysvalilegly

915920925

glnleugluasnlysgluvalvalaspleuserasnphemetproile

930935940

tyrglupheaspcysaspileilelysilegluglyasnlysleutyr

945950955960

alaleuglugluglyleuvallysvalthralaalavalthrtyrlys

965970975

glyargthrvalthrserproglumetmetleulysilethrlysasn

980985990

provalprolysthrilethrhisileaspserilethrvalvalala

99510001005

glylysglyglualaprovalleuproalathralavalalahis

101010151020

pheaspargglymetproargaspvallysvallystrpgluile

102510301035

valasnproalaleutyrglnasnleuglygluphethrvalser

104010451050

glyaspvalgluglythrgluilelysalaglnalalysvalmet

105510601065

valargseralaleualailegluthrilesermetalavalleu

107010751080

proasnglnlysprogluleuproglnlysvalthrvaltyrtyr

108510901095

seraspglythrglugluglnalaaspvalasptrpaspalamet

110011051110

proseralagluleulyssergluglyvalvallysvallysgly

111511201125

servallysglyvalaspleulysalathralaglnileargval

113011351140

thrsergluvalglyglyvalglnasnileserargalalysasn

114511501155

glytyrglutyrprolysalaglualaserphethrasnthrgly

116011651170

proglyserasnaspargileglualaileasnaspaspvalile

117511801185

sertyraspalagluprohisasnargtrpthrasntrpglnpro

119011951200

thrproargproglyasptrpvalserilethrpheglyaspser

120512101215

lysproarglystyraspileaspsermetgluilehistrptyr

122012251230

gluaspleuglythrserserproalatyrpheargileglntyr

123512401245

lysserglyaspglutrplysaspvalserglyleulysthrasn

125012551260

proserasnthrvalleuargglnalaasnvaltyrthrpheasp

126512701275

lysvalargthrseralaileargvalaspmetthralalysthr

128012851290

glylysserleualailethrgluilelysvalpheserlystrp

129513001305

alalysalahisthrhisprometvalthraspilelysleugly

131013151320

aspleuserileleuaspasppheserlyslysglyaspasnasn

132513301335

gluleuthrpheglnvallysaspproargaspileprogluile

134013451350

lysvallysalagluaspasnthrserilethrileileprothr

135513601365

phethralaproserthralalysileilealalyssergluasp

137013751380

glymetlysvalgluiletyrasnileargphethrglu

138513901395

<210>14

<211>1737

<212>prt

<213>芽孢杆菌属的种

<400>14

metlyslysalailesercysvalpheleuileseralaleuileleu

151015

serserpheglnvalprovalglnglyglnalametserlysthrthr

202530

seralaalaglyasnservalsertyraspglygluargargvalasn

354045

pheasngluasntrpargpheglnarggluthrasnglyserileala

505560

glyalaglnasnproglypheaspaspsersertrparglysleuasn

65707580

leuprohisasptrpserilegluleuasppheasnlysasnserleu

859095

alathrhisgluglyglytyrleuaspglyglyileglytrptyrarg

100105110

lysthrphethrileproglusermetlysglylysargileserleu

115120125

asppheaspglyvaltyrmetasnserthrthrtyrleuasnglyglu

130135140

valleuglythrtyrpropheglytyrasnalaphesertyraspile

145150155160

serasplysleutyrlysaspglyargalaasnvalleuvalvallys

165170175

valasnasnthrglnproserserargtrptyrserglyserglyile

180185190

tyrargasnvaltyrleuthrvalthraspproilehisvalalaarg

195200205

tyrglythrphevalthrthrproasnleuglulysserilelysglu

210215220

aspargalaaspvalasnilelysthrlysileserasnaspalaala

225230235240

glualalysglnvallysilelysserthriletyraspglyalagly

245250255

asnthrvalglnthrvalgluthrgluglulysthralaalaalagly

260265270

thrvalthrprophegluglnasnthrvalilelysglnprolysleu

275280285

trpserileasplysprotyrargtyrasnleuvalthrgluvalile

290295300

valglyglyglnthrvalaspthrtyrgluthrlyspheglyvalarg

305310315320

tyrphelyspheaspgluasngluglypheserleuasnglyglutyr

325330335

metlysleuhisglyvalsermethishisaspleuglyalaleugly

340345350

alaalathrasnalaargglyvalgluargglnmetglnilemetlys

355360365

aspmetglyvalasnalaileargvalthrhisasnproalaserpro

370375380

gluleuleuglualaalaasnlysleuglyleupheileilegluglu

385390395400

alapheaspsertrpalaglnserlyslysprotyrasptyrglyarg

405410415

phepheasnalatrpalagluhisaspilelysglumetvalasparg

420425430

glylysasngluproalaileilemettrpserileglyasngluile

435440445

tyraspthrthrasnalaalaglyvalgluthralaargasnleuval

450455460

glytrpvallysgluileaspthrthrargprothrthrileglyglu

465470475480

asplysthrargglyasplysvalasnvalthrproileasnsertyr

485490495

ilelysgluilepheasnilevalaspvalvalglyleuasntyrser

500505510

gluasnasntyraspglytyrhislysglnasnprosertrplysleu

515520525

tyrglysergluthrserseralathrargserargglyvaltyrthr

530535540

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alatrplystyraspargaspleulyshisilealaglyglnpheile

580585590

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595600605

tyrproalalyssersertyrpheglyalavalaspthralaglyphe

610615620

prolysaspilephetyrtyrtyrglnserglntrplyslysglupro

625630635640

metvalhisleuleuprohistrpasntrplysgluglyglulysval

645650655

argvalleualatyrthrasnalaserlysvalgluleuvalleuasn

660665670

glygluserleuglyglulysasntyraspasnlysglnthrsertrp

675680685

glyalaprotyrlysgluthrlysaspglylysthrtyrleuglutrp

690695700

alavalprophelysproglylysleuglualavalalalysaspglu

705710715720

asnglylysvalilealaargaspglnvalvalthralaglyglupro

725730735

alaservalargleuthralaasparglysvalvallysalaaspgly

740745750

thraspleuserpheilethralaaspilevalaspserlysglyile

755760765

valvalproaspalaasphisleuilethrpheasnvalthrglygln

770775780

glygluleualaglyvalaspasnglyasnalaserservalgluarg

785790795800

tyrlysaspasnlysarglysalapheserglylysalaleualaile

805810815

valglnserserlysleuserglylysilethrvalhisalaserval

820825830

alaglyleuserseraspserthrservalphethrvalthrproala

835840845

asphisasplyslysilevalalaglyileaspaspvalasnleuthr

850855860

valaspvalasnglualaprolysleuprosergluilelysvaltyr

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tyrseraspgluseralaalaalalysasnvalthrtrpaspgluval

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aspprolysglntyrserthrvalglygluphethrvalgluglyser

900905910

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ilevalalavallysprotyrserthralathrlysvalglyvalgln

930935940

provalleuproglulysalathrleuleutyrseraspglythrthr

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lysglyalathrvalthrtrpaspgluileprogluasplysleuala

965970975

lysgluglyargphethrvalgluglyservalgluglythraspleu

980985990

lysalaasnvaltyrvalargvalthrasngluvallysservalasn

99510001005

ilemetleuglngluglnglyseralatyrprolysleugluala

101010151020

thrphethrasnproalaaspasnleuglnhisleuasnaspgly

102510301035

ilelyssertyrthrasnasnprovalasnargtrpthrasntrp

104010451050

thrargthrproargaspalaglyaspserilethrvalasnphe

105510601065

glylyslyshisvalileasnasnleuaspleuphevalphethr

107010751080

aspserglythrvalvalproglulysalagluvalglntyrtrp

108510901095

aspglythralatrplysaspvalgluasnleuthrglnproser

110011051110

protyrvalvalglulysasngluleuthrpheaspalavalala

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thrglulysleulysphehisleuthrproservallysglylys

113011351140

pheleualaleuthrglualagluvaltyralaaspglnileval

114511501155

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alaleugluglypheasphisalalyslysasntyrgluleuval

117511801185

leuprotyrglysergluleuprolysileglualaalaalaala

119011951200

aspasnalathrvalthrileleuproalaphesertyrprogly

120512101215

thralalysleuphevalthrsergluaspglylysvalthrthr

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glutyrserileglyvalserthrglugluprolysleuvalser

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alagluleuseralaasplysthrasnvalmetgluaspaspile

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ilelysilegluglyasnlysleutyralaleugluthrglyasn

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vallysvallysvalthrvalthrtyrlysglyvalservalthr

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thrproalaleugluphethrilealalysasnproalaprolys

132513301335

tyrilethrserleugluprovalthrvalvalvallyslysgly

134013451350

glualaprogluleuproalathrvalvalalahistyrasnarg

135513601365

glyileproargaspvallysvallystrpgluargileasnpro

137013751380

serlystyrglnglnleuglygluphethrvalserglymetval

138513901395

gluglythraspilelysalaglnalalysvalilevallysgly

140014051410

alavalalavalgluaspileargmetalavalleuleulysgln

141514201425

metproglnleuproglylysvalthrvaltyrtyrseraspgly

143014351440

alaglugluglnargalavallystrpglugluileproglnglu

144514501455

gluleugluasnvalglygluphelysvallysglyaspvalasn

146014651470

glyvallysleulysalathralathrileargvalthraspglu

147514801485

valglyglygluglnasnileserargalalysasnglytyrglu

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tyrprolysalaglualaserphethrasnasnglyproglyser

150515101515

seraspargileglualaileasnaspaspvalilesertyrglu

152015251530

alaasnprohisasnargtrpthrasntrpglnprovalproarg

153515401545

alaglyasptrpvalserilethrpheglyasptyrgluprothr

155015551560

glutyraspvalaspsermetgluilehistrpphealaasphis

156515701575

glythrsertyrprogluargpheglnileglutyrlyssergly

158015851590

aspsertrplysgluvalthrserleulysseraspproalaser

159516001605

proalaleuglylysalaasnvaltyrserpheaspargvallys

161016151620

thrseralaileargvallysmetthralaglnalaglylysser

162516301635

leualailethrgluleulysvalpheserlystrpprolysala

164016451650

glythrgluprogluvalthraspilelysvalglyglylysser

165516601665

ileleugluaspphegluglnlysglyasphistyrgluvalthr

167016751680

ileaspalaglyaspalaasnvalmetprolysileasnvallys

168516901695

alalysaspglnthrserilethrilevalproalavalthrser

170017051710

proserthralalysvalilealalyssergluaspglylyslys

171517201725

vallysvaltyrserilehistyrlys

17301735

<210>15

<211>1025

<212>prt

<213>乳酸克鲁维酵母

<400>15

metsercysleuileprogluasnleuargasnprolyslysvalhis

151015

gluasnargleuprothrargalatyrtyrtyraspglnaspilephe

202530

gluserleuasnglyprotrpalaphealaleupheaspalaproleu

354045

aspalaproaspalalysasnleuasptrpgluthralalyslystrp

505560

serthrileservalproserhistrpgluleuglngluasptrplys

65707580

tyrglylysproiletyrthrasnvalglntyrproileproileasp

859095

ileproasnproprothrvalasnprothrglyvaltyralaargthr

100105110

phegluleuaspserlysserilegluserphegluhisargleuarg

115120125

phegluglyvalaspasncystyrgluleutyrvalasnglyglntyr

130135140

valglypheasnlysglyserargasnglyalaglupheaspilegln

145150155160

lystyrvalsergluglygluasnleuvalvalvallysvalphelys

165170175

trpseraspserthrtyrilegluaspglnaspglntrptrpleuser

180185190

glyiletyrargaspvalserleuleulysleuprolyslysalahis

195200205

ilegluaspvalargvalthrthrthrphevalaspserglntyrgln

210215220

aspalagluleuservallysvalaspvalglnglysersertyrasp

225230235240

hisileasnphethrleutyrgluprogluaspglyserlysvaltyr

245250255

aspalaserserleuleuasnglugluasnglyasnthrthrpheser

260265270

thrlysglupheileserpheserthrlyslysasnglugluthrala

275280285

phelysileasnvallysalaprogluhistrpthralagluasnpro

290295300

thrleutyrlystyrglnleuaspleuileglyseraspglyserval

305310315320

ileglnserilelyshishisvalglypheargglnvalgluleulys

325330335

aspglyasnilethrvalasnglylysaspileleupheargglyval

340345350

asnarghisasphishisproargpheglyargalavalproleuasp

355360365

phevalvalargaspleuileleumetlyslyspheasnileasnala

370375380

valargasnserhistyrproasnhisprolysvaltyraspleuphe

385390395400

asplysleuglyphetrpvalileaspglualaaspleugluthrhis

405410415

glyvalglnglupropheasnarghisthrasnleuglualaglutyr

420425430

proaspthrlysasnlysleutyraspvalasnalahistyrleuser

435440445

aspasnproglutyrgluvalalatyrleuaspargalaserglnleu

450455460

valleuargaspvalasnhisproserileileiletrpserleugly

465470475480

asnglualacystyrglyargasnhislysalamettyrlysleuile

485490495

lysglnleuaspprothrargleuvalhistyrgluglyaspleuasn

500505510

alaleuseralaaspilepheserphemettyrprothrphegluile

515520525

metgluargtrparglysasnhisthraspgluasnglylyspheglu

530535540

lysproleuileleucysglutyrglyhisalametglyasnglypro

545550555560

glyserleulysglutyrglngluleuphetyrlysglulysphetyr

565570575

glnglyglypheiletrpglutrpalaasnhisglyileglupheglu

580585590

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