一种覆盆子酮的工业化发酵生产方法与流程
[0001]
本发明属于覆盆子酮生产技术领域，具体涉及一种覆盆子酮的工业化发酵生产方法。
背景技术：
[0002]
覆盆子酮又名悬钩子酮，化学名4-对羟基苯基-2-丁酮。覆盆子酮是覆盆子的主要香气成分，是国内外大量使用的优雅果香的香料，广泛应用于化妆品和食品中，除此之外还可应用于合成医药等。
[0003]
现有技术中，关于覆盆子酮的合成方法的报道具体如下：
[0004]
(1)1996年，claudio fuganti等分别以baker
′
s yeast(tetrahedron，1996，52.4041-4052) 和beauveria bassiana(tetrahedron：asymmetry，1996，7，3129-3134)对4-羟基亚苄基丙酮 (如图1所示)中的烯键进行还原制备覆盆子酮。并且于1998年发表文章(journal ofmolecular catalysis b：enzymatic 1998，4，289-293)再次对能够催化还原烯键的问生物进行筛选，并对还原产物进行详尽的考察，发现某些微生物能选择性地还原烯键，而大多数微生物则同时还原烯键和羰基生成杜鹃醇。
[0005]
(2)1998年，whitehead，i.m.等(food technol1998，52，40-46)使用从发酵或植物提取来源的对羟基苯甲醛和发酵来源的丙酮通过醛缩酶催化缩合，而后经β-消去反应得到 4-羟基亚苄基丙酮，最后通过微生物催化烯键还原得到覆盆子酮。
[0006]
(3)2007年，g.feron等(letters in applied microbiology 2007，45，29-35)等利用基因工程宿主菌大肠杆菌表达源于细菌的醛缩酶(dera)实现了对羟基苯甲醛和丙酮的缩合，并通过过程优化，最终覆盆子酮合成关键中间体4-羟基亚苄基丙酮的产量达到160 mg/l。
[0007]
综上，以上各方法均停留在实验室水平，还无法实现覆盆子酮的工业化规模生产。
技术实现要素：
[0008]
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种覆盆子酮的工业化发酵生产方法。
[0009]
本发明的技术方案如下：
[0010]
一种覆盆子酮的工业化发酵生产方法，包括如下步骤：
[0011]
(1)以天然对香豆酸为原料，在放线菌actinomycetes sp.omk-74代谢下生成对羟基苯甲醛；
[0012]
(2)以步骤(1)所得的对羟基苯甲醛与丙酮为原料，在芽胞杆菌bacillus sp.omk-75 代谢下生成4-羟基苄叉丙酮；
[0013]
(3)以步骤(2)所得的4-羟基苄叉丙酮为原料，在酵母菌saccharomyces sp.omk-76 代谢下还原生成所述覆盆子酮；
[0014]
放线菌actinomycetes sp.omk-74于2020年10月16日保藏于中国典型培养物保藏
30℃培养至克隆子饱满；
[0028]
b、从上述克隆子中挑取单克隆子接种于第二种子培养基中，于29-30℃、180-220rpm 摇床培养或380-420rpm通风搅拌培养20-25h，获得第二种子培养液；
[0029]
c、将上述第二种子培养液以8-12％的接种量接种于第二发酵培养基中，于34-35℃、 ph＝6.5-7.0的条件下发酵培养8-12h至分光光度计测定od
600
不再增加时，一次性添加对羟基苯甲醛和丙酮分别至终浓度为38-42g/l和100-150g/l，再继续培养至底物反应完全或不再继续反应时，然后经纯化，获得所述对羟基苄叉丙酮。
[0030]
进一步优选的，所述第二种子培养基的配方如下表所示：
[0031][0032]
其中溶剂为水。
[0033]
进一步优选的，所述第二发酵培养基的配方如下表所示：
[0034][0035][0036]
其中溶剂为水。
[0037]
在本发明的一个优选实施方案中，所述步骤(3)包括：
[0038]
a、取甘油冷藏的酵母菌saccharomyces sp.omk-76进行平板划线，所得平板置于 27-28℃培养至克隆子饱满；
[0039]
b、从上述克隆子中挑取单克隆子接种于第三种子培养基中，于29-30℃、180-220rpm 摇床培养或380-420rpm通风搅拌培养20-25h，获得第三种子培养液；
[0040]
c、将上述第三种子培养液以8-12％的接种量接种于第三发酵培养基中，于29-30
℃、自然ph的条件下发酵培养8-12h至分光光度计测定od
600
不再增加时，一次性添加对羟基苄叉丙酮至终浓度为48-52g/l，再继续培养至底物反应完全或不再继续反应时，然后经纯化，获得所述覆盆子酮。
[0041]
进一步优选的，所述第三种子培养基的配方如下表所示：
[0042][0043]
其中溶剂为水。
[0044]
进一步优选的，所述第三发酵培养基的配方如下表所示：
[0045][0046][0047]
其中溶剂为水。
[0048]
本发明的有益效果是：本发明通过三步发酵，实现了高效的生物法合成覆盆子酮的生产工艺。第一步：以天然对香豆酸为原料，在微生物(放线菌actinomycetes sp.omk-74) 代谢下生成天然对羟基苯甲醛；第二步：对羟基苯甲醛和丙酮在微生物(芽胞杆菌bacillussp.omk-75)代谢下生成4-羟基苄叉丙酮；最后4-羟基苄叉丙酮经过酵母菌(酵母菌 saccharomyces sp.omk-76)特异且高效还原生成覆盆子酮。
附图说明
[0049]
图1为本发明实施例1的技术路线图。
具体实施方式
[0050]
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
[0051]
实施例1
[0052]
本实施例中所涉及的微生物从海洋土壤众多微生物中分离筛选出而得到，其中：放线菌actinomycetes sp.omk-74于2020年10月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no：m 2020584；芽胞杆菌bacillus sp.omk-75于2020年10月16 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no：m 2020585；酵母菌 saccharomyces sp.omk-76于2020年10月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no：m 2020586。
[0053]
如图1所示，一种覆盆子酮的工业化发酵生产方法，包括如下步骤：
[0054]
(1)以天然对香豆酸为原料，在放线菌actinomycetes sp.omk-74代谢下生成对羟基苯甲醛，具体包括：
[0055]
a、取一管-80℃冰箱甘油冷藏的放线菌actinomycetes sp.omk-74于新鲜、无菌平板上平板划线，所得平板置于培养箱26℃培养72h至克隆子饱满；
[0056]
b、从上述克隆子中挑取单克隆子接种于装有1.8l第一种子培养基的3l生物反应器中，于37℃、300rpm通风搅拌培养24h，获得第一种子培养液，镜检无杂菌后，准备接种于发酵罐；
[0057]
c、将上述第一种子培养液以10％的接种量接种于装有10.2l第一发酵培养基的20l 生物反应器(经121℃灭菌30min)中，于37℃、ph＝7.0-7.5(使用30％氢氧化钠溶液自动控制)、400rpm搅拌转速、通气比为1∶0.2的条件下发酵培养12h至分光光度计测定 od
600
不再增加时，一次性添加对香豆酸至终浓度为50g/l(共600g)，再继续培养48h 至底物反应完全或不再继续反应时(每4h测样)，发酵结束用hplc法测定发酵液中对羟基苯甲醛的浓度为35g/l，然后经纯化，获得所述对羟基苯甲醛；
[0058]
第一种子培养基的配方如下表所示：
[0059][0060]
其中溶剂为水；
[0061]
第一发酵培养基的配方如下表所示：
[0062][0063]
其中溶剂为水；
[0064]
(2)以步骤(1)所得的对羟基苯甲醛与丙酮为原料，在芽胞杆菌bacillus sp.omk-75 代谢下生成4-羟基苄叉丙酮，具体包括：
[0065]
a、取一管-80℃冰箱甘油冷藏的芽胞杆菌bacillus sp.omk-75于新鲜、无菌平板上平板划线，所得平板置于30℃培养箱培养24h至克隆子饱满；
[0066]
b、从上述克隆子中挑取单克隆子接种于装有1.8l第一种子培养基的3l生物反应器中，于30℃、400rpm通风搅拌培养24h，获得第二种子培养液，镜检无杂菌后，准备接种于发酵罐；
[0067]
c、将上述第二种子培养液以10％的接种量接种于装有10.2l第二发酵培养基的生物反应器(经121℃灭菌30min)中，于35℃、ph＝6.5-7.0(使用30％氢氧化钠溶液自动控制)、500rpm搅拌转速、通气比为1∶0.3的条件下发酵培养10h至分光光度计测定od
600
不再增加时，一次性添加对羟基苯甲醛和丙酮分别至终浓度为40g/l(共306g)和100g/l，再继续培养72h至底物反应完全或不再继续反应时(每4h测样)，发酵结束用hplc法测定发酵液中对羟基苄叉丙酮的浓度为50g/l，然后经纯化，获得所述对羟基苄叉丙酮；
[0068]
第二种子培养基的配方如下表所示：
[0069][0070]
其中溶剂为水；
[0071]
第二发酵培养基的配方如下表所示：
[0072][0073]
其中溶剂为水；
[0074]
(3)以步骤(2)所得的4-羟基苄叉丙酮为原料，在酵母菌saccharomyces sp.omk-76 代谢下还原生成所述覆盆子酮，具体包括：
[0075]
a、取一管-80℃冰箱甘油冷藏的酵母菌saccharomyces sp.omk-76于新鲜、无菌平板上平板划线，所得平板置于28℃培养箱培养24h至克隆子饱满；
[0076]
b、从上述克隆子中挑取单克隆子接种于装有1.8l第一种子培养基的3l生物反应器中，于30℃、400rpm通风搅拌培养24h，获得第三种子培养液，镜检无杂菌后，准备接种于发酵罐；
[0077]
c、将上述第三种子培养液以10％的接种量接种于装有10.2l第二发酵培养基的生物反应器(经121℃灭菌30min)中，于30℃、自然ph、500rpm搅拌转速、通气比为1∶0.35 的条件下发酵培养10h至分光光度计测定od
600
不再增加时，一次性添加对羟基苄叉丙酮至终浓度为40g/l(共480g)和葡萄糖至终浓度100g/l，再继续培养72h至底物反应完全或不再继续反应时(每4h测样)，发酵结束用hplc法测定发酵液中覆盆子酮的浓度为39.5g/l，然后经纯化，获得所述覆盆子酮；
[0078]
第三种子培养基的配方如下表所示：
[0079][0080]
其中溶剂为水；
[0081]
第三发酵培养基的配方如下表所示：
[0082][0083][0084]
其中溶剂为水。
[0085]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
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覆盆子酮（树莓酮）
覆盆子酮的制备
覆盆子酮，又称为覆盆子苷或树莓酮，是一种天然化合物
一种香料覆盆子酮的制备方法
覆盆子提取物 覆盆子酮5% 覆盆子黄酮 树莓酮 森元
食品级覆盆子酮，覆盆子酮生产厂家
覆盆子酮的产品用途
网址: 一种覆盆子酮的工业化发酵生产方法与流程 https://m.trfsz.com/newsview1309331.html
