首页 > 资讯 > 一种富含维生素k2的菌菇粉及其制备方法

一种富含维生素k2的菌菇粉及其制备方法

泰然健康网
2025-06-16 08:21

一种富含维生素k2的菌菇粉及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种富含维生素K2的菌菇粉，该菌粉中富含多种营养物质，维生素K2含量在200ug/g以上，同时含有多种蛋白、膳食纤维及微量元素。本发明还公开了这种菌菇粉的制备方法。本发明是以自主筛选的纳豆芽孢杆菌(保藏编号CCTCC M2014405)为出发菌株，以提取过活性多糖的菌菇渣为主要氮源，通过合适的发酵控制手段，繁殖大量的菌体细胞，收集细胞，经膜过滤或离心、喷雾干燥制得富含维生素K2的菌菇粉。该菌菇粉具有治疗和预防骨质疏松、促进心血管健康、修复损伤细胞、抗肿瘤等功效。本发明为维生素K2的工业化生产、菌菇渣的综合利用以及开发新的保健食品奠定了基础，开辟了生产维生素K2的新途径。
CCTCC NO:M2014405
2014.09.09
【专利说明】一种富含维生素K2的菌菇粉及其制备方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种富含维生素K2的菌菇粉及其制备方法，属于生物【技术领域】。

【背景技术】
[0002] 维生素K2是一类脂溶性凝血类维生素，为甲萘醌类系列化合物，在骨质疏松症的预防和治疗方面具有显著的效果，被称为"第四代抗骨质疏松产品"。维生素K2是一类化合物--甲基萘醌类化合物，根据其分子结构上C-3位异戊二烯侧链的长短不同共有14种形式，以MK-n表示（n指侧链上异戊二烯单位的个数），甲萘醌-4 (MK-4)和甲萘醌-7 (MK-7) 最为常见，MK-4与维生素Kl分子量相似，均具有很短的血清半衰期，要实现血液循环需要很大的剂量，比MK-7推荐剂量高1000倍。而MK-7可快速被肠道吸收，由大的脂质颗粒所运输，在循环系统中停留很长时间，血液半衰期长，有能力在除肝脏外的骨骼和动脉中发挥作用。本发明所制备的维生素K2属于MK-7构型。
[0003] 维生素K2可以迅速改善由于维生素K缺乏引起的出血，因此几十年来维生素K2 一直被用作治疗出血的抗凝药物，并未作为人体内一种重要营养物被关注。除了作为抗凝药物外，维生素K2最显著的功能为改善骨骼和心血管健康。根据报道，维生素K2还可以： 1)抗动脉钙化及骨关节炎；2)抗肿瘤；3)延缓衰老；4)修复损伤细胞，潜在的治疗帕金森症药物，广泛地应用于医药、食品等领域。随着对维生素K2生理功能研究的深入和加强，维生素K2的应用越来越广泛，并得到了权威机构的认可。2005年日本批准维生素K2作为抗骨质疏松药物上市。我国国家食品药品监督管理局也将维生素K2列入"营养补充剂申报与审评规定（试行）"的"维生素、矿物质化合物名单"中（国食药监注[2005]202号），可用做保健食品或营养强化剂的原料。2008年1月，维生素K2通过美国食品药品监督管理局 (FDA)安全认定。2009年，欧洲议会和欧盟理事会决定在其所有成员国中，维生素K2可用作保健食品或营养强化剂的原料（2009/345/EC)。
[0004] 灰树花、香菇、姬松茸、猴头菇、鸡腿菇是常见的药食两用菌，他们含有丰富的营养物质。如：每百克干香菇中，含蛋白质13克，脂肪1.8克，钙124毫克，磷415毫克，铁25. 3 毫克，以及丰富的维生素B1、B2、C、D等。香菇蛋白质由18氨基酸组成，占人体必需氨基酸总量的35. 9%，营养价值很高。灰树花被誉为"食用菌王子"和"华北人参"，其干品含有蛋白质25. 2克（其中含有人体所需氨基酸18种18. 68克，其中必需基酸占45. 5% )脂肪3. 2 克、膳食纤维33. 7克、碳水化合物21. 4克，并富含多种有益的矿物质和维生素，多种营养素居各种食用菌之首。猴头菇有"山珍猴头、海味鱼翅"之称，含有猴头菌酮、碱及葡聚糖、麦角甾醇、猴菇菌素和多糖等，具有补脾胃、助消化、益肾精等功效。上述菌菇经过水浸提活性多糖后，菌菇渣中仍含有大量的蛋白质，膳食纤维等活性物质，用其做原料发酵，一方面可以作为氮源提供微生物生长，另一方面其他活性物质仍保留，提高后续产品的营养价值。
[0005] 目前国内关于维生素K2制备的专利主要集中在：（1)菌种诱变筛选；（2)维生素 K2的提纯；没有利用廉价原料进行维生素K2生产的专利，更没有利用灰树花渣、香菇渣等此类药食兼用、具有很好保健作用和药用价值的菌菇渣做原料进行维生素K2生产的实例。

【发明内容】

[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种富含维生素K2的菌菇粉。
[0007] 本发明还要解决的技术问题是提供上述菌菇粉的制备方法。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0009] -种富含维生素K2的菌菇粉的制备方法，以纳豆芽孢杆菌为出发菌株，以提取过活性多糖的菌菇渣为主要氮源，发酵菌体细胞，收集细胞，经膜过滤或离心、收集固体部分经喷雾干燥制得富含维生素K2的菌菇粉。
[0010] 其中，所述的维生素K2为MK-7型。
[0011] 具体的制备方法，包括如下步骤：
[0012] (1)利用粗碎机将提取过活性多糖的菌菇渣进行初步粉碎，再用超微粉碎机进行精细粉碎，入筛粉机过200目筛,获得原始菌菇粉；
[0013] (2)将保存在甘油管的纳豆芽孢杆菌接入固体培养基中进行菌种活化，37°C培养箱中培养，20?28h，连续活化两代；
[0014] (3)利用灭菌后的生理盐水将斜面上的菌洗下，接入装有50mL种子培养基的 250mL摇瓶中，在30?37°C的摇床中，以120?200rpm的转速，培养24?48h，获得一级种子液；
[0015] (4)将一级种子接入装有IOOmL种子培养基的500mL摇瓶中，接种量2?10% (v/ v)在30?37°C的摇床中，以120?200rpm的转速，培养24?48h，获得二级种子液；[0016] (5)将二级种子接入装有发酵培养基的发酵罐中，接种量2?10% (v/v)，加入消泡齐U，维持pH在7. 0左右，通气量0? 2?2vvm，搅拌转速200?600rpm，罐温30?37°C，培养64?96h，发酵生产维生素K2;所述的发酵培养基以步骤（1)得到的原始菌菇粉为主要氮源；
[0017] (6)将发酵液经管式分离膜设备或离心机分水，浓缩物料至200g/L以上，滤液经纳滤截留维生素K2;
[0018] (7)将浓缩物料和截留物料经喷雾干燥机干燥得到富含维生素K2的菌菇粉。
[0019] 步骤（1)中，所述的提取过活性多糖的菌菇渣为提取过香菇多糖的香菇渣、提取过灰树花多糖的灰树花渣、提取过姬松茸多糖的姬松茸渣、提取过鸡腿菇多糖的鸡腿菇渣和提取过猴头菇多糖的猴头菇渣中的任意一种或几种的混合物。
[0020] 步骤⑵中，所述的纳豆芽孢杆菌，其分类命名为纳豆芽孢杆菌R127 (Bacillus natto R127)，已保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072,其保藏编号为CCTCC NO :M 2014405,保藏日期为2014年9月9日。该纳豆芽孢杆菌从江苏省南京市市场上购买的纳豆产品中获得，后经紫外诱变，筛选获得蛋白酶活性较高菌种。通过该菌株发酵制备的维生素K2为MK-7型。
[0021] 纳豆芽孢杆菌CCTCC NO :M 2014405菌株特性如下：
[0022] (1)菌落形态：将菌种稀释涂布在固体培养基上，30_37°C培养，24h后，菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色；
[0023](2)菌体形态：在光学显微镜下观察CCTCC NO :M 2014405的形态及结构，菌体为杆状，单个细胞长〇. 5-3微米，革兰氏阳性菌，好氧，含有芽孢，位于菌体中央或稍偏；
[0024] (3)液体培养：静置培养表面会产生一层白色的生物膜，震荡培养细胞生长速度快，无白色膜；
[0025] (4)代谢：主要代谢产物为七烯甲基萘醌构型的维生素K2,该菌株在25-40°C均能生长，其中30_37°C为最适生长温度；菌体适合在中性pH培养液中生长。
[0026] (5)胞外酶：可产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等，可分解胞外含氮原料，如大豆粉、菌渣等。
[0027] 通过形态及培养特性判定本菌为芽孢菌属的微生物，为进一步对所获得的菌株进行鉴定，借用分子生物学手段对其16sRNA序列（如SEQ ID No :1所示）进行比对。发现本菌与Bacillus subtilis的16SRNA序列存在96%的同源性，因此判定本菌株属于芽孢杆菌，命名为 Bacillus natto R127。
[0028]步骤（2)、（3)或（4)中，所述的固体培养基配方为：30g/L葡萄糖，40g/L蛋白胨， 5g/L NaCl，5g/L牛肉膏，5g/L酵母膏，30g/L琼脂，溶剂为水。种子培养基配方为10-50g/ L葡萄糖，20-80g/L蛋白胨，2-10g/L NaCl，2-10g/L牛肉膏，2-10g/L酵母膏，溶剂为水。种子培养基优选配方为：30g/L葡萄糖，40g/L蛋白胨，5g/L NaCl，5g/L牛肉膏，5g/L酵母膏，溶剂为水。发酵培养基配方为30-80g/L甘油，20-100g/L大豆蛋白胨，0. 2-1. 5g/L酵母粉， 0. l-lg/LK2HP04,0. I-IgAXaCl2 ?%0,0. l-lg/LMgS04 *7H20,溶剂为水。发酵培养基优选配方为：50g/L 甘油，30g/L 大豆蛋白胨，0? 6g/L 酵母粉，0? 3g/LK2HP04,0. IgAXaCl2 ? H20,0? 3g/ LMgSO4 ? 7H20,溶剂为水。
[0029] 步骤（5)中，所述的消泡剂为silicone SE-2,使用量为0?2_3g/L，优选0?3g/L。
[0030] 步骤（5)中，发酵罐中发酵产维生素K2油脂采用间歇式发酵或补料式发酵方法。
[0031] 步骤（5)中，发酵罐采用养鱼用的气石（微孔分布器）作为气体分布器。
[0032] 步骤（5)中，原始菌菇粉在作为主要氮源加入发酵培养基之前，先经过碱性蛋白酶水解的预处理。水解条件：温度30?60°C，转速150?300rpm，时间1?3h，pH7?10，将不可溶的蛋白进行分解后，再进行发酵。
[0033] 本发明所采取的工艺方法同样适用于纳豆芽孢杆菌同均属的其他菌株以及在此基础上进行诱变获得的菌种，如Bacillus subtilis CICC10262、Bacillus subtilis CGMCC NO. 8400 等，最适的菌种为 CCTCC NO :M 2014405。
[0034] 上述制备方法制备得到的富含维生素K2的菌菇粉也在本发明的保护范围之内。
[0035] 该菌菇粉具有以下营养特性：
[0036] (1)富含 100ug/g_300ug/g 的维生素 K2;
[0037] (2)粒度可过200目筛；
[0038] (3)含有干燥后的芽孢杆菌菌粉；
[0039] (4)含有一定量的蛋白质、膳食纤维、微量元素（如维生素D、矿物质）、少量脂类物质（如：麦角留醇）；
[0040] 上述富含维生素K2的菌菇粉在制备具有预防骨质疏松、心血管健康、延缓衰老、抗癌或修复损伤细胞功能的保健食品或者药品中的应用也在本发明的保护范围之内。
[0041] 本发明所制备的菌菇粉除了含有维生素K2外，还含有维生素D，在钙吸收方面具有明显效果，维生素D可促进钙在小肠的吸收，将钙转化为血钙，而维生素K2可促进血钙向骨钙的转化，让钙流向该去的地方，防止因钙在血管等部位的堆积形成的血管硬化等问题的发生，是补钙的完美组合，再加上近期在Science等文章中报道的维生素K2在修复损伤细胞等方面的功效，因此本发明所提供的菌菇粉在预防骨质疏松、心血管健康、延缓衰老、抗癌或修复损伤细胞功能等方面具有保健功能。
[0042]目前的补钙产品主要是钙片加维生素D，维生素D是促进钙吸收，变成血液中的钙，而补钙的目的是补到骨骼上，维生素K2主要是促进血钙转化成骨钙，本发明所提供的这种菌菇粉，富含l〇〇ug/g以上的维生素K2,此外，香菇本身就含有少量的维生素D，菌菇渣中也有保留，所以，本产品中既含有VD，又含有VK2，是优良的补钙产品。
[0043] 有益效果：本发明提供了一种富含维生素K2的菌菇粉，其营养价值高，口味芳香，适合用作制备预防和治疗骨质疏松、预防心血管健康、延缓衰老、抗癌、修复损伤细胞等功能的保健食品或者药品。同时本发明还提供了这种菌菇粉的制备方法，以纳豆芽孢杆菌 (CCTCC NO :M 2014405)为出发菌株，以提取过活性多糖的菌菇渣为主要氮源，发酵积累维生素K2,收集细胞，经膜过滤或离心、喷雾干燥制得富含维生素K2的菌菇粉。该方法获得的维生素K2产量与利用大豆粉、大豆蛋白胨等氮源的浓度接近，具有产业化潜力，制备的菌菇粉中含有l〇〇_3〇〇ug/g维生素K2,当今国际上MK7用于骨质疏松的有效剂量为45-125 微克（成人剂量），因此每日食用不到Ig的该菌菇粉即可达到膳食补充要求。此外，菌菇中自身含有所中微量元素，如维生素D，与维生素K2联合使用，是优良的补钙产品。

【专利附图】

【附图说明】
[0044] 图1为发酵样品维生素K2(MK_7)质谱图。

【具体实施方式】
[0045] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0046] 实施例1:菌株筛选
[0047] 取Ig纳豆产品溶解于IOOml生理盐水中，振荡混合均匀，将样品悬液按照每级稀释10倍的次序制得KT 1-IO-7个浓度，分别将KT3-IO-7五个浓度中吸取IOOul稀释液加到筛选培养基中涂布，每个浓度涂三块板，37 °C，培养48h，挑选可产生水解圈且较大的菌落，继续在筛选培养基中划线，获得纯菌，经发酵复筛，高效液相分析及质谱鉴定，获得可产维生素K2的菌种Bacillus natto R，且该菌株所产维生素K2为MK-7构型（如图1)。
[0048] 为提高菌种分解蛋白的能力，对所得Bacillus natto R进行诱变筛选：将活化后的菌液用生理盐水洗涤，将菌悬液在紫外灯下照射，照射距离30cm，每隔20s取样，最后选择180s，致死率在80%左右的条件进行诱变筛选，所得诱变菌液稀释涂布在筛选培养基中，筛选透明圈较大的菌株，命名为Bacillus natto R127,保藏于中国典型微生物菌种保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO :M 2014405。
[0049] 筛选培养基为：4g干酪素溶于100ml水中，115°C灭菌20min，牛肉膏3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，琼脂20g，溶于900ml水中，121 °C，灭菌20min，冷却至50°C左右，将两者混合，倒平板待用。
[0050] HPLC方法：色谱柱：C18柱，柱温：50°C，流动相：甲醇，流速：lml/min，紫外检测波长270nm，进样量：30ul，检测时间：35min。
[0051] 实施例2 :菌株基本生长性能考察。
[0052] 对筛选获得的菌株CCTCC NO :M 2014405进行基本性能考察，采用不同液体种子培养基进行培养，考察细胞生长速率，结果如表1，所用培养基为（％表不每IOOml培养基中含有物质的质量g):
[0053] 培养基I :100mL豆芽汁，5 %蔗糖
[0054] 培养基2 :1%葡萄糖，1%蛋白胨，0?5% NaCl
[0055] 培养基3 :3%葡萄糖，4%蛋白胨，0. 5% NaCl，0. 5%牛肉膏，0. 5%酵母膏
[0056] 培养基4 :0. 5%葡萄糖，1%蛋白胨，0. 5% NaCl，0. 5%牛肉膏，0. 5%酵母膏
[0057] 表1不同种子培养基菌体生长情况表
[0058]

【权利要求】
1. 一种富含维生素K2的菌菇粉的制备方法，其特征在于，以纳豆芽孢杆菌为出发菌株，以提取过活性多糖的菌菇渣为主要氮源，发酵菌体细胞，收集细胞，经膜过滤或离心、收集固体部分经喷雾干燥制得富含维生素K2的菌菇粉。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的维生素K2为MK-7型。
3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，它包括如下步骤： (1) 利用粗碎机将提取过活性多糖的菌菇渣进行初步粉碎，再用超微粉碎机进行精细粉碎，入筛粉机过200目筛,获得原始菌菇粉； (2) 将保存在甘油管的纳豆芽孢杆菌接入固体培养基中进行菌种活化，37°C培养箱中培养，20?28h，连续活化两代； (3) 利用灭菌后的生理盐水将斜面上的菌洗下，接入装有50mL种子培养基的250mL摇瓶中，在30?37°C的摇床中，以120?200rpm的转速，培养24?48h，获得一级种子液； (4) 将一级种子接入装有IOOmL种子培养基的500mL摇瓶中，接种量2?10% (v/v) 在30?37°C的摇床中，以120?200rpm的转速，培养24?48h，获得二级种子液； (5) 将二级种子接入装有发酵培养基的发酵罐中，接种量2?10% (v/v)，加入消泡齐U，维持PH在7. 0左右，通气量0? 2?2vvm，搅拌转速200?600rpm，罐温30?37°C，培养64?96h，发酵生产维生素K2 ;所述的发酵培养基以步骤（1)得到的原始菌菇粉为主要氮源； (6) 将发酵液经管式分离膜设备或离心机分水，浓缩物料至200g/L以上，滤液经纳滤截留维生素K2; (7) 将浓缩物料和截留物料经喷雾干燥机干燥得到富含维生素K2的菌菇粉。
4. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1)中，所述的提取过活性多糖的菌菇渣为提取过香菇多糖的香菇渣、提取过灰树花多糖的灰树花渣、提取过姬松茸多糖的姬松茸渣、提取过鸡腿菇多糖的鸡腿菇渣和提取过猴头菇多糖的猴头菇渣中的任意一种或几种的混合物。
5. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（2)中，所述的纳豆芽孢杆菌，其分类命名为纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2014405,保藏日期为2014年9月9日。
6. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的固体培养基配方为30g/L葡萄糖，40g/L蛋白胨，5g/LNaCl，5g/L牛肉膏，5g/L酵母膏，30g/L琼脂，溶剂为水；种子培养基配方为10_50g/L葡萄糖，20-80g/L蛋白胨，2-10g/L NaCl，2-10g/L牛肉膏，2-10g/L酵母膏，溶剂为水；发酵培养基配方为30-80g/L甘油，20-100g/L大豆蛋白胨，0. 2-1.5g/L酵母粉，0? l-lg/LK2HP04,0. I-IgAXaCl2 ? H20,0. l-lg/LMgS04 ? 7H20,溶剂为水。
7. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（5)中，发酵罐中发酵产维生素 K2油脂采用间歇式发酵或补料式发酵方法；发酵罐采用微孔分布器作为发酵罐的气体分布器。
8. 根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（5)中，原始菌菇粉在作为主要氮源加入发酵培养基之前，先经过碱性蛋白酶水解的预处理。
9. 权利要求1?8中任意一项制备方法制备得到的富含维生素K2的菌菇粉。
10. 权利要求9所述的菌菇粉在制备具有预防骨质疏松、心血管健康、延缓衰老、抗癌或修复损伤细胞功能的保健食品或者药品中的应用。
【文档编号】A23L1/28GK104323222SQ201410473168
【公开日】2015年2月4日申请日期:2014年9月16日优先权日:2014年9月16日
【发明者】黄和, 邱宏伟, 任路静, 王星丽申请人:丽水双健生物工程有限公司