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一种高纯度低聚半乳糖的绿色制备方法与流程

泰然健康网
2024-12-24 19:44

本发明属于功能性低聚糖制备技术领域，涉及一种高纯度低聚半乳糖的绿色制备方法，包括含β-半乳糖苷酶胞内酶的酵母全细胞的发酵制备，也包括利用乙醇溶液透性化处理酵母全细胞，且包括利用透性化酵母细胞催化乳糖制备低聚半乳糖，还包括利用酵母全细胞反应纯化低聚半乳糖粗品获得高纯度低聚半乳糖，而且该方法中透性化酵母细胞和酵母全细胞都可重复循环利用，实现了“一种酵母，两种用途”的高纯度低聚半乳糖绿色循环制备。

背景技术：

低聚半乳糖(galacto-oligosaccharides,gos)是一类重要的益生因子，能有效促进肠道内的双歧杆菌增殖，具有防止便秘、改善矿物质吸收和脂质代谢、促进维生素生成、提高免疫力、抗衰老和抗肿瘤等功能，是一种重要的功能性食品添加剂。gos通常由乳糖经β-半乳糖苷酶(β-d-galactosidegalactohydrolases，ec3.2.1.23)的转糖苷作用催化制得。但是，由于β-半乳糖苷酶本身也是一种糖苷水解酶，在gos的合成反应中，不仅存在着乳糖通过转糖苷作用催化合成目标产物gos的反应，还存在着乳糖被水解生成葡萄糖和半乳糖的副反应，这不仅降低目标产物gos的收率，而且使gos粗品中同时存在着葡萄糖、半乳糖和未反应的乳糖等产品，为后续高纯度gos产品的纯化制备带来了困难。

目前对于gos的纯化方法主要有膜分离法、色谱层析法、乙醇沉淀法和超临界流体萃取法等。这些方法对设备要求高，操作复杂且成本高，通常所得产品纯度不超过65％，不利于大规模生产高纯度gos。

技术实现要素：

为解决上述纯化难题，本发明开发了一种酵母发酵法反应纯化gos的新技术。酵母能以葡萄糖、半乳糖和乳糖作为碳源进行繁殖生长，是一种可以应用在食品领域中的对人类安全的微生物。而且酵母在适宜的培养条件下，生长代谢速率快，周期短，便于工业大规模生产。将酵母全细胞添加至gos粗品中，可以利用其可代谢消耗葡萄糖、半乳糖和乳糖，但不降解gos的特点，将gos粗品中的杂糖组分去除，提高gos的纯度。本发明利用一种酵母实现gos催化制备与反应纯化的两种用途，操作简单、成本低、可循环利用，所得gos产品纯度高，有利于工业应用和推广。

本发明的技术方案如下:

一种高纯度低聚半乳糖的绿色制备方法，包括如下步骤：

1)含β-半乳糖苷酶胞内酶的酵母全细胞的发酵制备；

2)利用乙醇溶液透性化处理酵母全细胞；

3)利用透性化酵母细胞催化乳糖制备低聚半乳糖；

4)利用酵母全细胞反应纯化低聚半乳糖粗品获得高纯度低聚半乳糖。

所述步骤1)的方法是：将酵母单克隆接种到种子液培养基中制备酵母种子液，然后向富含乳糖的生物质培养基加入0.1～10％(v/v)酵母种子液，在温度为16～37℃，搅拌转速为50～500rpm，ph值为4～10的条件下发酵制备，发酵时间为8～48h，发酵液为浓度1～20g/l的酵母全细胞的发酵液。

所述的酵母选自毕赤酵母、酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母或脆壁克鲁维酵母。

所述的种子液培养基是每升培养基中含有1～30g酵母膏，1～30g蛋白胨和1～10g氯化钠；所述的富含乳糖的生物质选自乳糖、乳清或乳清粉；所述的培养基是每升培养基中含有1～100g富含乳糖的生物质，1～30g酵母膏和1～30g蛋白胨；所述的酵母全细胞含有β-半乳糖苷酶胞内酶；所述的发酵液中还含有浓度为5～40g/l的乙醇。

所述步骤2)的方法是：将上述所述的发酵液进行离心分离，获得酵母全细胞沉淀和发酵上清液，酵母全细胞沉淀用于透性化处理和低聚半乳糖粗品的反应纯化；采用浓度为20％～50％(v/v)的乙醇溶液透性化处理浓度为1～100g/l的酵母全细胞，透性化处理温度为0～37℃，透性化处理时间为5s～5min，离心分离获得乙醇处理液和透性化酵母细胞，向透性化酵母细胞加入1％～10％(w/v)ph值为4～10的50mm磷酸钠缓冲液洗涤，再离心除去上清液，获得β-半乳糖苷酶胞内酶酶活为每克干细胞1×103～4×104u的透性化酵母细胞。

所述步骤3)的方法是：在透性化酵母细胞浓度为5～40g/l，温度为20～50℃，ph值为4～10和搅拌转速为50～500rpm的条件下，采用透性化酵母细胞酶法催化浓度为100～500g/l的乳糖制备低聚半乳糖，催化反应0.25～18h后，获得浓度为1～150g/l的低聚半乳糖粗品，同时产生浓度为50～150g/l的葡萄糖和浓度为20～100g/l的半乳糖副产物，催化反应结束后还含有浓度为10～200g/l的乳糖残留；将低聚半乳糖粗品进行离心分离，获得低聚半乳糖上清液和透性化酵母细胞沉淀，低聚半乳糖上清液用于高纯度低聚半乳糖的反应纯化。

所述步骤4)的方法是：将上述所述的低聚半乳糖上清液进行1到10倍的稀释，加入浓度为1～100g/l的酵母全细胞，在温度为15～40℃，ph为4～10和搅拌转速为10～500rpm的条件下进行发酵培养，消耗乳糖、葡萄糖和半乳糖以纯化低聚半乳糖上清液，纯化时间为1～30h，获得纯化后低聚半乳糖溶液，经过离心分离获得纯化后低聚半乳糖上清液和酵母全细胞沉淀，低聚半乳糖上清液经过蒸馏浓缩获得纯度为65％～99％的低聚半乳糖产品。

本发明的所述的离心条件为离心转速1000～15000rpm，离心时间1～20min。

所述的发酵上清液通过蒸馏获得浓度为20～50％(v/v)的乙醇溶液，用于酵母全细胞透性化处理；所述的蒸馏温度为60～100℃；所述的乙醇处理液可在步骤2)中酵母全细胞沉淀透性化处理重复循环利用。

所述的透性化酵母细胞沉淀可在步骤3)中催化乳糖制备低聚半乳糖重复循环利用。

所述的纯化后低聚半乳糖溶液含有乙醇；所述的纯化后低聚半乳糖上清液经过蒸馏浓缩可获得20％～50％(v/v)乙醇溶液，可用于酵母全细胞透性化处理；所述的酵母全细胞沉淀可在步骤4)中反应纯化低聚半乳糖粗品重复循环利用。

本发明提供一种高纯度低聚半乳糖的绿色制备方法，与现有技术相比具有以下优点：

(1)根据本发明所述的高纯度低聚半乳糖的绿色制备方法，通过“一种酵母，两种用途”实现低聚半乳糖的催化制备与反应纯化，低聚半乳糖终产物纯度最高可达到99％，解决了现有技术中低聚半乳糖生产成本高、纯度低的问题。

(2)本发明采用透性化酵母细胞制备低聚半乳糖，避免β-半乳糖苷酶胞内酶的提取和纯化步骤，减少酶活损失，同时透性化酵母细胞可以重复循环利用，提高了酶的利用效率，降低了酶制剂的成本。

(3)本发明在酵母全细胞的发酵制备阶段和低聚半乳糖粗品的反应纯化阶段都可产生乙醇，实现了高纯度低聚半乳糖和乙醇同步生产，降低了生产成本。

(4)本发明所获得的乙醇可通过蒸馏浓缩得到高浓度乙醇产品，用于酵母全细胞的透性化处理，不仅降低透性化处理的成本，而且避免其他来源乙醇的使用，从而保证透性化酵母细胞的食品安全性。

(5)本发明所述的酵母全细胞、透性化酵母细胞和乙醇处理液都可以重复循环利用，可以大幅度降低低聚半乳糖的制备成本，在制备过程中也可避免对环境的污染，实现了绿色循环制备。

(6)本发明所述的高纯度低聚半乳糖的绿色制备方法工艺简单，不添加有害物质，所需设备成本低，产品纯度高，易于大规模工业推广。

附图说明

图1高纯度低聚半乳糖(gos)的绿色制备的操作流程。

图2透性化毕赤酵母细胞催化100g/l乳糖制备gos的时程曲线图(▼：乳糖；●：低聚半乳糖；▲：葡萄糖；■：半乳糖)。

图3毕赤酵母全细胞反应纯化gos粗品的时程曲线图(▼：乳糖；●：低聚半乳糖；▲：葡萄糖；■：半乳糖)。

图4透性化酿酒酵母细胞催化500g/l乳糖制备gos的时程曲线图(▼：乳糖；●：低聚半乳糖；▲：葡萄糖；■：半乳糖)。

图5酿酒酵母全细胞反应纯化gos粗品的时程曲线图(▼：乳糖；●：低聚半乳糖；▲：葡萄糖；■：半乳糖)。

图6透性化乳酸克鲁维酵母细胞催化400g/l乳糖制备gos的时程曲线图(▼：乳糖；●：低聚半乳糖；▲：葡萄糖；■：半乳糖)。

图7透性化乳酸克鲁维酵母细胞催化制备gos的重复循环利用研究(ygos：gos在总糖中的百分含量)。

图8乳酸克鲁维酵母全细胞反应纯化gos粗品的时程曲线图(▼：乳糖；●：低聚半乳糖；▲：葡萄糖；■：半乳糖)。

图9乳酸克鲁维酵母全细胞反应纯化gos粗品的重复循环利用研究(ygos：gos在总糖中的百分含量)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。对本发明内容所做的等同替换，或相应的改进，仍属于本发明的保护范围之内。

本发明所述的一种高纯度低聚半乳糖的绿色制备方法(图1)，包括下述步骤：

1)含β-半乳糖苷酶胞内酶的酵母全细胞的发酵制备

将酵母单克隆接种到种子液培养基中制备酵母种子液，然后向富含乳糖的生物质培养基加入0.1～10％(v/v)酵母种子液，在温度为16～37℃，搅拌转速为50～500rpm，ph值为4～10的条件下发酵制备，发酵时间为8～48h，可得含有浓度为1～20g/l的酵母全细胞的发酵液。

2)利用乙醇溶液透性化处理酵母全细胞

将上述所述的发酵液进行离心分离，获得酵母全细胞沉淀和发酵上清液，酵母全细胞沉淀用于透性化处理和低聚半乳糖粗品的反应纯化。采用浓度为20％～50％(v/v)的乙醇溶液透性化处理浓度为1～100g/l的酵母全细胞，透性化处理温度为0～37℃，透性化处理时间为5s～5min，离心分离获得乙醇处理液和透性化酵母细胞，向后者加入1％～10％(w/v)ph值为4～10的50mm磷酸钠缓冲液洗涤，再离心除去上清液，获得β-半乳糖苷酶胞内酶酶活为每克干细胞1×103～4×104u的透性化酵母细胞。

3)利用透性化酵母细胞催化乳糖制备低聚半乳糖

在透性化酵母细胞浓度为5～40g/l，温度为20～50℃，ph值为4～10和搅拌转速为50～500rpm的条件下，采用透性化酵母细胞酶法催化浓度为100～500g/l的乳糖制备低聚半乳糖，催化反应0.25～18h后，可获得浓度为1～150g/l的低聚半乳糖粗品，同时也产生浓度为50～150g/l的葡萄糖和浓度为20～100g/l的半乳糖副产物，催化反应结束后还含有浓度为10～200g/l的乳糖残留；将低聚半乳糖粗品进行离心分离，获得低聚半乳糖上清液和透性化酵母细胞沉淀，前者用于高纯度低聚半乳糖的反应纯化。

4)利用酵母全细胞反应纯化低聚半乳糖粗品获得高纯度低聚半乳糖

将上述所述的低聚半乳糖上清液进行1到10倍的稀释，加入浓度为1～100g/l的酵母全细胞，在温度为15～40℃，ph为4～10和搅拌转速为10～500rpm的条件下进行发酵培养，消耗乳糖、葡萄糖和半乳糖以纯化低聚半乳糖上清液，纯化时间为1～30h，可获得纯化后低聚半乳糖溶液，经过离心分离获得纯化后低聚半乳糖上清液和酵母全细胞沉淀，前者经过蒸馏浓缩可获得纯度为65％～99％的低聚半乳糖产品。

实施例一

含β-半乳糖苷酶胞内酶的毕赤酵母全细胞的发酵制备

将保存的毕赤酵母菌种接种至平板固体lb培养基上，30℃培养72h，制得活化单菌落。取活化的单菌落接种至液体lb培养基中，30℃、160rpm震荡扩大培养20h，得到种子培养液。在500ml锥形瓶中，将0.1ml种子培养液接入100ml发酵培养基中，在初始ph值4.0，转速50rpm，温度16℃条件下培养48h，获得发酵液，离心分离得到毕赤酵母全细胞沉淀和发酵上清液，毕赤酵母全细胞沉淀用于透性化处理和低聚半乳糖(gos)粗品的反应纯化，发酵上清液除去。发酵培养基配方如下：乳清粉100g/l，蛋白胨1g/l，酵母膏1g/l，121℃灭菌20min。

利用乙醇溶液透性化处理毕赤酵母全细胞

利用20％(v/v)的乙醇溶液对浓度为1g/l的毕赤酵母全细胞在0℃条件下进行透性化处理5s，离心分离获得乙醇处理液和透性化毕赤酵母细胞沉淀，乙醇处理液除去，向透性化毕赤酵母细胞沉淀加入1％(w/v)ph值为4的浓度为50mmol/l磷酸钠缓冲液洗涤，再离心除去上清液，获得透性化毕赤酵母细胞。

利用透性化毕赤酵母细胞催化乳糖制备gos

配制乳糖溶液至质量浓度为100g/l，加入5g/l透性化毕赤酵母细胞，反应条件为温度20℃，ph4.0，搅拌转速50rpm，每半小时取一个样，通过hplc检测gos、乳糖、葡萄糖和半乳糖浓度。实验结果如图2所示，反应2.5h后，得到gos粗品，其含有2.6％的gos，19.2％的残留乳糖，39.9％副产物葡萄糖和38.9％副产物半乳糖。经过1000rpm离心20min，获得gos上清液和透性化毕赤酵母细胞沉淀，gos上清液用于反应纯化，透性化毕赤酵母细胞沉淀除去。

利用毕赤酵母全细胞反应纯化gos粗品获得高纯度低聚半乳糖

将gos上清液稀释至总碳水化合物浓度为100g/l，加入1g/l毕赤酵母全细胞，反应条件为15℃，ph4，搅拌转速10rpm，每3小时取一个样，通过hplc检测gos、乳糖、葡萄糖和半乳糖浓度。实验结果如图3所示，随着纯化时间的延长，乳糖、葡萄糖和半乳糖不断被消耗，而gos不被降解消耗，纯化18h后，乳糖、葡萄糖和半乳糖几乎被完全消耗，实现了gos的纯化。经过1000rpm离心20min，得到纯化后gos上清液和毕赤酵母全细胞沉淀，纯化后gos上清液经过蒸馏浓缩得到纯度为65％的gos产品，毕赤酵母全细胞沉淀除去。

实施例二

含β-半乳糖苷酶胞内酶的酿酒酵母全细胞的发酵制备

将保存的酿酒酵母菌种接种至平板固体lb培养基上，30℃培养72h，制得活化单菌落。取活化的单菌落接种至液体lb培养基中，30℃、160rpm震荡扩大培养20h，得到种子培养液。在500ml锥形瓶中，将10ml种子培养液接入100ml发酵培养基中，在初始ph值为10，转速为500rpm，温度为37℃条件下培养8h，获得发酵液，离心分离得到酿酒酵母全细胞沉淀和发酵上清液，酿酒酵母全细胞沉淀用于透性化处理和gos粗品的反应纯化，发酵上清液除去。发酵培养基配方如下：乳清100ml/l，蛋白胨30g/l，酵母膏30g/l，121℃灭菌20min。

利用乙醇溶液透性化处理毕赤酵母全细胞

利用50％(v/v)的乙醇溶液对浓度为100g/l酿酒酵母全细胞在37℃条件下进行透性化处理5min，离心分离获得乙醇处理液和透性化酿酒酵母细胞沉淀，乙醇处理液除去，向透性化酿酒酵母细胞沉淀加入10％(w/v)ph值为10的浓度为50mmol/l磷酸钠缓冲液洗涤，再离心除去上清液，获得透性化酿酒酵母细胞。

利用透性化酿酒酵母细胞催化乳糖制备gos

配制乳糖溶液至质量浓度为500g/l，加入40g/l透性化酿酒酵母细胞，反应条件为温度50℃，ph10.0，搅拌转速500rpm，每20分钟取一个样，通过hplc检测gos、乳糖、葡萄糖和半乳糖浓度。实验结果如图4所示，反应60min后，gos浓度达到最高值，gos粗品含有20.0％的gos，37.6％的残留乳糖，26.6％副产物葡萄糖和15.8％副产物半乳糖。经过15000rpm离心1min，获得gos上清液和透性化酿酒酵母细胞沉淀，gos上清液用于反应纯化，透性化酿酒酵母细胞沉淀除去。

利用酿酒酵母全细胞反应纯化gos粗品

将gos上清液稀释至总碳水化合物浓度为50g/l，加入100g/l酿酒酵母全细胞，反应条件为40℃，ph10.0，搅拌转速500rpm，每3小时取一个样，通过hplc检测gos、乳糖、葡萄糖和半乳糖浓度。实验结果如图5所示，随着纯化时间的延长，乳糖、葡萄糖和半乳糖不断被消耗，而gos不被降解消耗，纯化12h后，乳糖、葡萄糖和半乳糖几乎被完全消耗，实现了gos的纯化。经过15000rpm离心1min，得到纯化后gos上清液和酿酒酵母全细胞沉淀，纯化后gos上清液经过蒸馏浓缩得到纯度为99％的gos产品，酿酒酵母全细胞沉淀除去。

实施例三

含β-半乳糖苷酶胞内酶的乳酸克鲁维酵母全细胞的发酵制备

将保存的乳酸克鲁维酵母菌种接种至平板固体lb培养基上，30℃培养72h，制得活化单菌落。取活化的单菌落接种至液体lb培养基中，30℃、160rpm震荡扩大培养20h，得到种子培养液。在7-l发酵罐中，将200ml种子培养液接入4l发酵培养基中，在初始ph值8.48，转速200rpm，通气量1vvm，温度27.6℃条件下培养16h，获得发酵液，离心分离得到乳酸克鲁维酵母全细胞沉淀和发酵上清液，乳酸克鲁维酵母全细胞沉淀用于透性化处理和gos粗品的反应纯化，发酵上清液用于蒸馏浓缩。发酵培养基配方如下：乳糖60g/l，蛋白胨5g/l，酵母膏12g/l，121℃灭菌20min。

利用乙醇溶液透性化处理乳酸克鲁维酵母全细胞

所得发酵上清液含有浓度为30g/l的乙醇，通过蒸馏浓缩(温度为80℃)获得35％(v/v)乙醇溶液，利用35％(v/v)的乙醇溶液对浓度为50g/l乳酸克鲁维酵母全细胞在室温下进行透性化处理2min，离心分离获得乙醇处理液和透性化乳酸克鲁维酵母细胞沉淀，乙醇处理液继续用于透性化处理，可重复3次，向透性化乳酸克鲁维酵母细胞沉淀加入5％(w/v)ph值为8的浓度为50mmol/l磷酸钠缓冲液洗涤，再离心除去上清液，获得透性化细胞。

利用透性化乳酸克鲁维酵母细胞催化乳糖制备gos

配制乳糖溶液至质量浓度为400g/l，加入18.87g/l透性化乳酸克鲁维酵母细胞，反应条件为温度40℃，ph8.0，搅拌转速150rpm，每20分钟取一个样，通过hplc检测gos、乳糖、葡萄糖和半乳糖浓度。实验结果如图6所示，反应1.5h后，得到gos粗品，其含有35.0％的gos，27.4％的残留乳糖，25.2％副产物葡萄糖和12.4％副产物半乳糖。经过5000rpm离心5min，获得gos上清液和透性化乳酸克鲁维酵母细胞沉淀，gos上清液用于反应纯化，透性化乳酸克鲁维酵母细胞沉淀继续用于催化乳糖制备gos，可重复循环利用，如图7所示，透性化细胞重复利用14次，gos粗品的得率维持在34.8％～35.7％之间。

利用乳酸克鲁维酵母全细胞反应纯化gos粗品

将gos粗品稀释至总碳水化合物浓度为100g/l，加入15g/l乳酸克鲁维酵母全细胞，反应条件为30℃，ph8.0，搅拌转速150rpm，每小时取一个样，通过hplc检测gos、乳糖、葡萄糖和半乳糖浓度。实验结果如图8所示，随着纯化时间的延长，乳糖、葡萄糖和半乳糖不断被消耗，而gos不被降解消耗，纯化15h后，乳糖、葡萄糖和半乳糖几乎被完全消耗，实现了gos的纯化。经过5000rpm离心5min，得到纯化后gos上清液和乳酸克鲁维酵母全细胞沉淀，纯化后gos上清液经过蒸馏浓缩得到浓度为35％(v/v)的高浓度乙醇和浓缩的高纯度gos产品，乳酸克鲁维酵母全细胞沉淀继续用于反应纯化，可重复循环利用，如图9所示，重复利用9次以上，gos的纯度维持在95％～99％。