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一种覆盆子酮的微生物发酵生产方法与流程

泰然健康网
2025-05-22 16:18

本发明属于生物合成领域中的微生物发酵合成，具体涉及一种覆盆子酮的微生物发酵生产方法。

背景技术：

1、覆盆子酮，又叫树莓酮(raspberry ketone,rk)，化学名为4-(4-羟基苯基)-2-丁酮，主要存在于树莓中，广泛用于香水，化妆品中，并可以为食品和饮料增香。覆盆子酮具有良好的生物活性功能，如对脂肪肝的调节作用、保护并提高肝脏功能、保护心脏、调节血脂及减肥降脂功能、调节血糖及抗糖尿病功能、抗氧化功能、抗炎症功能等，在医药领域也有广阔的应用前景。

2、覆盆子酮的生产主要有提取法、化学法和生物法等。提取法一般采用天然植物原料如树莓果实，利用溶剂提取法或者辅助其他手段提取，但由于天然植物原料中覆盆子酮含量较低，使得提取产量低，而且提取过程复杂，导致天然提取的覆盆子酮价格高，不适合大规模工业生产。化学法合成树莓酮具有产量高、价格低等优点。化学合成可以采用天然原料合成，如利用天然茴香醛与天然丙酮催化羟醛缩合生产前体苯甲醚丙酮；随后，苯甲醚丙酮通过镍或钯/碳催化加氢转化为茴香基丙酮；最后，通过茴香基丙酮的去甲基化反应得到树莓酮；但是此法合成受到原料价格以及使用催化剂等因素限制。其他化学合成法如采用苯酚-丁酮醇、苯酚-甲基乙烯酮、对羟基苯甲醛-丙酮、甲氧基苄氯-乙酰乙酸乙酯等原料合成，这些化学法合成会产生诸如有毒化学试剂残留、重金属催化剂残留、酸碱腐蚀、副产物难以去除、产品有不良气味影响等问题，影响到化学法合成合成的覆盆子酮在医药、食品、化妆品等领域中的应用；另外，化学法合成造成的环境污染问题也不容忽视。

3、与化学法合成相比，利用微生物的生命活动产生的酶及活性物质生产目标化合物的生物合成法，以其制备过程中条件温和安全，生产工艺绿色环保而体现出特别的优势，已经逐渐引起重视。生物法合成应用于覆盆子酮的合成也受到关注。

4、覆盆子酮(树莓酮)是苯丙氨酸的衍生物通过复杂且紧密联系的酶和调节系统产生的。覆盆子酮通过苯丙烷途径产生，该途径的前体是芳香族氨基酸。芳香族氨基酸的生物合成始于莽草酸途径。第一步，二羟丙酮磷酸合成酶缩合磷酸戊糖途径衍生的赤藓糖-4-磷酸和糖酵解途径衍生的磷酸烯醇式丙酮酸，进一步的酶促步骤生成该途径的最终产物分支酸。分支酸变位酶1随后将分支酸转化为预苯酸，最后预苯酸可能通过龙原酸途径在植物中生物合成苯丙氨酸。苯丙氨酸也可能在分支酸变位酶2的作用下在细胞质中通过苯丙酮酸途径生成。

5、对香豆酰辅酶a是树莓酮在植物中合成的底物之一，通过苯丙烷合成途径生成，苯丙氨酸解氨酶催化苯丙氨酸脱氨生成肉桂酸，肉桂酸羟基化酶催化肉桂酸生成对-香豆酸，对-香豆酰辅酶a连接酶催化对-香豆酸生成对-香豆酰辅酶a。由于对香豆酸价格低廉，在合成过程中通常外源添加以提高树莓酮的产量。

6、丙二酰辅酶a是树莓酮合成的另一个底物，首先通过乙酰辅酶a羧化酶催化乙酰辅酶a生成丙二酰辅酶a。一分子的丙二酰辅酶a和一分子的对香豆酰辅酶a在苯亚甲基丙酮合酶的催化下，脱羧缩合生成苯亚甲基丙酮，最后在苯亚甲基丙酮还原酶的催化下，还原生成目标化合物树莓酮。

7、以上是植物中合成覆盆子酮的途径，利用微生物进行生物合成树莓酮的方法根据此途径及途径中的关键酶，通过基因工程手段，对微生物进行基因编辑，将相关酶的基因转入微生物中，获得能够表达树莓酮合成途径相关酶的转基因微生物，如大肠杆菌等，再利用转基因微生物发酵生产树莓酮。

8、目前已经公布的生物合成法，主要是采用前期研究获得的基因工程菌的发酵法合成。例如，2022年有研究者报道通过外加简单碳源在大肠杆菌中合成树莓酮；报道者构建了从葡萄糖生产树莓酮的微生物平台；通过基因工程和苯丙氨酸解氨酶优化使葡萄糖分别产生19.3g/l和1.9g/l的酪氨酸和对香豆酸；产生对香豆酸的菌株含有质粒以表达对香豆酸连接酶、苯甲丙酮合酶进而从葡萄糖生产树莓酮；通过遗传和化学操作增加细胞中丙二酰辅酶a的含量，提高了树莓酮的产量；最后，在最佳条件下补料分批培养以葡萄糖为碳源发酵生产62mg/l的树莓酮。又如，王程程等人报道在大肠杆菌(escherichia coli)w3110中引入来源于植物的对-香豆酰辅酶a连接酶、苯亚甲基丙酮合酶和苯亚甲基丙酮还原酶基因，成功构建了重组菌株wcc-1；通过对起始诱导时间、诱导剂异丙基硫代半乳糖苷浓度、诱导温度的优化，该菌株摇瓶发酵产树莓酮质量浓度可达125.86mg/l；在3l发酵罐上进行补料分批发酵，树莓酮质量浓度提高到178.13mg/l。再如，2020年有报道在谷氨酸棒状杆菌(corymebacterium glutamicum)中成功地构建了从对香豆酸生产树莓酮的异源途径，产生的菌株积累了高达99.80mg/l的树莓酮。

9、国家知识产权局专利局公布的专利申请中，申请号202011316680x(申请公布号：cn112391418a)公布了一种覆盆子酮的工业化发酵生产方法，采用3种微生物通过3个阶段的发酵获得覆盆子酮。第一阶段采用放线菌actinomycetes sp.omk-74，以对香豆酸为主要原料发酵生产对羟基苯甲醛；第二阶段以芽孢杆菌bacillus sp.omk-75为发酵菌种，以第一阶段合成然后经过纯化的对羟基苯甲醛与丙酮为主要原料，合成4-羟基苄叉丙酮；第三阶段以第二阶段合成然后经过纯化的羟基苄叉丙酮为主要原料，以酵母菌saccharomycesomk-75为发酵菌种，发酵培养并经过纯化，得到覆盆子酮。此方法利用3个不同菌种，经过3个阶段的发酵培养，并经过3次分离纯化，得到最终产物覆盆子酮；除去种子液制备及活化时间，发酵产覆盆子酮的培养时间共约300小时即12.5天(见其具体实施方式)，其中中间产物需要经过2次纯化，才能够进行后续反应。国家知识产权局专利局公布的另一项专利申请(专利申请号：2018106524422，申请公布号：cn108753852a)，分别将来源于植物欧芹、掌叶大黄、覆盆子的4-香豆酰辅酶a连接酶、苄基丙酮合酶和苄基丙酮还原酶利用基因工程手段转入大肠杆菌表达，之后进行摇瓶发酵条件下获得70.62mg/l的覆盆子酮。以上方法均实现了覆盆子酮的微生物发酵生产，但是目前微生物发酵法仍存在前期基因工程菌构建操作复杂、原料价格高、基因工程菌的稳定性或者长时间的发酵污染风险等不利因素，在工业化应用时受到限制。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种覆盆子酮的微生物发酵生产方法，以农业生产废弃物为发酵培养基原料，采用分离自树莓果实的天然酵母菌一步发酵法生产覆盆子酮，解决操作复杂、发酵周期长、原料价格高等问题。

2、本发明通过如下技术方案实现。一种覆盆子酮的微生物发酵生产方法，其特征在于，操作步骤包括，s1：发酵菌种的活化，s2：发酵种子液的制备，s3：灭菌树莓叶提取液的制备，s4：灭菌竹笋皮提取液的制备，s5：发酵培养基的配制，s6：生产接种及覆盆子酮的发酵，s7：覆盆子酮产品获得。

3、所述发酵培养基的配方，按重量份计，由如下组分组成：灭菌树莓叶提取液250-450份，灭菌竹笋皮提取液200-450份，灭菌烟酸母液0.2-2份，灭菌蛋氨酸母液1-10份，余量由灭菌水补充至所述发酵培养基总重量份为1000份，混合均匀后，无菌条件下调节ph为4.5-6.5；

4、所述发酵菌种为陆生伊萨酵母(issatchenkia terricola)wjl-g4，于2019年10月21日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmcc no.18712。

5、具体操作细节按如下方案进行。

6、s1：发酵菌种的活化。

7、取安瓿瓶中保存的陆生伊萨酵母(issatchenkia terricola)wjl-g4菌种，接种到ypd液体培养基中，在25-28℃、120-250rpm、装液量为30ml的250ml的锥形瓶中培养24h后，梯度稀释到10-6，吸取100μl，涂布到ypd固体培养基中25-28℃下培养24h，挑取单菌落接种到ypd斜面培养基，25-28℃下培养24-36h，得到活化菌种。

8、s2：发酵种子液的制备。

9、挑取一环s1得到的活化菌种，接种到新的ypd液体培养基中，在25-28℃、120-250rpm、装液量体积比为10％-25％条件下，培养24h后，加入无菌玻璃珠，振荡20min，调节菌体浓度至1.0×107-5.0×107cfu/ml，得到发酵种子液。

10、s3：灭菌树莓叶提取液的制备。

11、所述树莓叶为蔷薇科悬钩子属植物树莓的新鲜叶片，新鲜树莓叶片采摘后，蒸馏水清洗除去表面杂质并沥干水分，得到清洗树莓叶，将清洗树莓叶速冻后保存于-15℃至-20℃，得到冷冻树莓叶；取清洗树莓叶或者在25-45℃解冻30min的冷冻树莓叶，剪碎研磨，得到树莓叶研磨浆，按照树莓叶研磨浆与蒸馏水的重量比1:1-2加入蒸馏水后，使用破壁机打浆1-3min，得到打浆树莓叶，向打浆树莓叶添加纤维素酶，纤维素酶添加重量为打浆树莓叶重量的0.01-0.05％，搅拌均匀后，在容器口盖上一层保鲜膜，恒温35-55℃酶解0.5-1.5h后，置于超声波提取器中，开启超声波提取器进行同时酶解与提取，时间为0.2-0.5h，超声波提取器设定条件为，输入功率200-350w、超声频率20-30khz，所述同时酶解与提取完成后，迅速升温至90℃灭酶5分钟，接着用8层纱布过滤，滤液采用巴氏灭菌法灭菌，之后冷却到22-28℃，得到灭菌树莓叶提取液。

12、作为优选，所述树莓叶研磨浆与蒸馏水的重量比为1:1.4-1.6。

13、作为优选，所述纤维素酶的添加重量为打浆树莓叶重量的0.02-0.03％，酶解时间为0.8-1.2h，温度为42-46℃。

14、作为优选，所述同时酶解与提取时间为0.3-0.4h，超声波提取器设定条件为输入功率250-280w、超声频率为23-26khz。

15、s4：灭菌竹笋皮提取液的制备

16、所述竹笋皮为禾本科竹属的多年生植物竹的新鲜嫩笋的鲜外皮去掉最外层与空气直接接触已经纤维化的部分后得到的内层新鲜竹笋皮，取内层新鲜竹笋皮用蒸馏水清洗去除土壤残渣等杂质，沥干表面水分，得到清洗竹笋皮，将清洗竹笋皮速冻后保存于-15至-20℃，得到冷冻竹笋皮；取清洗竹笋皮或者在25-45℃解冻30min的冷冻竹笋皮，剪碎研磨，得到竹笋皮研磨浆，按照竹笋皮研磨浆与蒸馏水的重量比1:1-2加入蒸馏水后，使用破壁机打浆1-3min，得到竹笋皮浆，向竹笋皮浆添加纤维素酶，纤维素酶添加重量为竹笋皮浆重量的0.01-0.05％，混合均匀后，在容器口盖上一层保鲜膜，温度恒温在35-52℃，酶解0.5-1.5h，之后置于超声波提取器中进行酶解同时提取；所述酶解同时提取条件为，超声波提取器设定在输入功率200-400w、超声频率在15-20khz，温度恒温在35-52℃，所述酶解同时提取时间为0.1-0.5h，之后，迅速升温至90℃灭酶5分钟，接着用8层纱布过滤，滤液采用巴氏灭菌法灭菌，之后冷却至22-28℃，得到灭菌竹笋皮提取液。

17、作为优选，所述竹笋皮研磨浆与蒸馏水的重量比为1:1.3-1.7。

18、作为优选，所述纤维素酶的添加重量为竹笋皮浆重量的0.02-0.03％，酶解时间为0.8-1.2h，温度为42-46℃。

19、作为优选，所述酶解同时提取条件为，超声波提取器设定在输入功率280-300w、超声频率在16-17khz，温度恒温在42-46℃，时间为0.2-0.3h。

20、s5：发酵培养基的配制

21、首先配制灭菌烟酸母液和灭菌蛋氨酸母液。称取烟酸按照烟酸:蒸馏水的重量比为1:20的比例混合，获得烟酸母液；称取蛋氨酸按照蛋氨酸:蒸馏水的重量比为1:20的比例混合，获得蛋氨酸母液；将两种母液均在121℃条件下灭菌15分钟，分别获得所述灭菌烟酸母液和所述灭菌蛋氨酸母液。

22、按照所述发酵培养基的配方重量份及组成比例对各个组分进行量取和混合：

23、灭菌树莓叶提取液250-450份；

24、灭菌竹笋皮提取液200-450份；

25、灭菌烟酸母液0.2-2份；

26、灭菌蛋氨酸母液1-10份；

27、余量由灭菌水补充所述发酵培养基的总重量份至1000份；

28、混合均匀后，无菌调节ph为4.5-6.5，得到所述的发酵培养基。

29、作为优选，所述发酵培养基中灭菌树莓叶提取液的重量份为300-350份。

30、作为优选，所述发酵培养基中灭菌竹笋皮提取液的重量份为250-350份。

31、作为优选，所述灭菌烟酸母液的重量份为1.0-1.2份。

32、作为优选，所述灭菌蛋氨酸母液的重量份为5-6份。

33、作为优选，所述发酵培养基的ph调整为5.0-6.0。

34、s6：生产接种及覆盆子酮的发酵。

35、取s2步骤得到的所述发酵种子液，按照所述发酵种子液与所述发酵培养基的重量比为1-10:100的比例，进行生产接种，得到发酵混合液，然后进行覆盆子酮的发酵培养，条件为，温度22-28℃、转速120-250rpm，装液量体积比20％-55％，发酵时间20-48h，获得覆盆子酮发酵液。

36、作为优选，所述生产接种步骤中所述发酵种子液与所述发酵培养基的重量比为6-7:10。

37、作为优选，所述覆盆子酮的发酵步骤中，发酵温度为24-26℃、转速160-200rpm，装液量体积比35-40％，发酵24-46h。

38、可选的，所述覆盆子酮的发酵采用分批补料发酵方法，在接种后发酵进行到18-24h时，向所述正在发酵的发酵混合液中分别加入所述灭菌树莓叶提取液和所述灭菌竹笋皮提取液，加入的所述灭菌树莓叶提取液重量份为30-50份，加入的所述灭菌竹笋皮提取液重量份为20-50份。

39、作为优选，分批补料发酵中，加入的所述灭菌树莓叶提取液重量份为42-45份，所述灭菌竹笋皮提取液的加入重量份为30-35份。

40、s7：覆盆子酮产品获得。

41、覆盆子酮的发酵步骤完成后，进行覆盆子酮的分离提取纯化，此步按照公知方法进行，如利用制备型高效液相色谱法分离纯化，获得覆盆子酮产品。

42、本发明优点

43、本发明充分利用农业生产的废弃物如树莓叶和竹笋皮，即有效利用资源，减少了浪费，又减少了丢弃的农业废弃物对环境的污染；同时发酵培养基成本很低，产出的树莓酮具有很高的经济价值，达到了变废为宝的效果。

44、本发明只需要一步发酵即可完成覆盆子酮的发酵生产，发酵的菌种为来自树莓果实的天然菌株，发酵条件温和，发酵时间短，效率高，产量高，发酵培养基绿色环保，工业化生产所需设备为常规发酵设备，操作简单、可行性强。

45、生物保藏信息

46、所述陆生伊萨酵母(issatchenkia terricola)wjl-g4，于2019年10月21日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmcc no.18712，建议的分类命名为：陆生伊萨酵母issatchenkia terricola，检测结果是存活，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。