一种抑制青枯菌增殖的绿茶抑菌剂及其制备方法与流程
本发明涉及一种抑制土传病害青枯菌增殖的农药制备方法，具体为一种抑制青枯菌增殖的绿茶抑菌剂及其制备方法。
背景技术：
农药是用来影响和调控有害生物生长发育或繁殖的特殊功能分子。每年全世界有10亿吨左右的农作物毁灭于病虫害。因此，农药自发明以来就在农业发展史中扮演重要角色，直到今天，农药的作用仍然不可替代。中国是世界上最大的农药产品生产国，但大量高毒农药的使用造成的问题也不断暴露，首先是消费者对农药毒性、农药残留的关注度越来越高，即对食品安全的担忧；其次是对农药造成环境污染的关注度越来越高，即对环境安全的担忧；由于农药残留过高致使我国农产品出口也遇到不少壁垒和障碍，并已经造成了巨大经济损失。因此，对人类健康安全无害、对环境友好、超低用量、高选择性，以及通过绿色工艺流程生产出来的“绿色农药”成为国内外农业领域专家研究和开发的热点。
茄科青枯病是由土传病害青枯菌(ralstoniasolanacearum)引起的毁灭性病害，广泛分布于全球热带，亚热带和温带地区，在我国长江流域及南方地区普遍发生。该病原菌寄主范围广，能侵染包括花生、烟草、番茄、马铃薯、香蕉在内的50多科近450种植物。近年来，随着全国范围内大棚蔬菜(番茄，茄子，辣椒等)种植面积的扩大，青枯病已成为常见、易发和传播迅速的重要土传病害之一，严重影响了蔬菜的产量和品质。随着科学技术的发展，青枯病的防治措施已由原来的化学防治为主发展为集成农业防治、选用抗病品种、物理、化学和生物防治为一体的综合防治体系。生物防治受自然界影响比较明显，防治效果没有化学农药见效快，但是化学农药对作物及土壤都有一定伤害，因此对环境友好且符合现代农业可持续发展战略理念的绿色防治方法备受科研人员的关注。
茶叶在我国具有悠久历史和深刻文化底蕴，也是具有高经济价值的特色经济作物，在我国农业和对外贸易中都占有非常重要的地位。现代研究证明茶多酚对普通变形杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、乳酸杆菌、肉毒杆菌、黄色弧菌、霍乱弧菌、副溶血弧菌、蜡状芽胞杆菌、肠炎沙门氏菌、绿脓杆菌、福氏痢疾杆菌、宋氏痢疾杆菌、伤寒杆菌等都具有不同程度的抑制和杀伤作用，并且对某些农作物的病原菌具有独特的抑制作用,而逐渐被发展为一种新型的生化农药和良好的植物生长促进剂。但是目前研究多数停留在对茶叶中的某个或几个单体化学成分的单一抑菌效应，而茶的化学活性成分很多，单一抑菌效应也忽略了各个成分之间在功能上的协同效应，且单体化学活性成分的研究和应用的成本较高，作为开发新一代抑菌剂的应用和推广程度不高。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种种抑制青枯菌增殖的绿茶抑菌剂及其制备方法，该方法生产成本较低，不受资源限制，环境污染小，可大量生产且产品比较安全；得到的绿茶抑菌剂能自行分解，无毒性残留，对人体无害，使用安全。
本发明是通过以下技术方案来实现：
一种抑制青枯菌增殖的绿茶抑菌剂制备方法，包括如下步骤，
步骤1，以炒青绿茶为原料，恒温恒湿下平衡后，在2～20℃下超微粉碎1～3h，室温下过2000目筛，得到茶粉平均粒径小于14μm的超微绿茶粉，所得超微绿茶粉在30～50℃下干燥后备用；
步骤2a，称取一定量超微绿茶粉，按照比例1-5％w/v加入水配成绿茶溶液，水浴加热后静置沉淀，取上清液真空抽滤后得到的滤液为绿茶粉抑菌剂。
优选的，步骤2a中，绿茶溶液在70～90℃下水浴加热20～50分钟，静置沉淀3～6h后取上清液。
优选的，步骤2a中得到的绿茶粉抑菌剂中加入咖啡碱，咖啡碱和超微绿茶粉的质量比为(2～8):(1～5)。
一种抑制青枯菌增殖的绿茶抑菌剂制备方法，包括如下步骤，
步骤1，以炒青绿茶为原料，恒温恒湿下平衡后，在4～20℃下超微粉碎，并在室温下过2000目筛，得到茶粉平均粒径小于14μm的超微绿茶粉，所得超微绿茶粉在30～50℃下干燥后备用；
步骤2b，称取一定质量炒青绿茶，溶于40～60％v/v乙醇，料液比为1:15～30，水浴加热提取茶多酚粗品，40～60℃干燥后备用；
步骤3a，按照一定比例配制绿茶抑菌剂，在甲醇中先添加1～5％w/v的超微绿茶粉，溶解后再分别添加1～5％w/v的茶多酚粗品和2～8％w/v的咖啡碱，在40～80℃下充分混合，加入甲醇体积3-5倍的水定容后，即获得绿茶抑菌剂。
一种抑制青枯菌增殖的绿茶抑菌剂制备方法，包括如下步骤，
步骤1，以炒青绿茶为原料，恒温恒湿下平衡后，在4～20℃下超微粉碎，并在室温下过2000目筛，得到茶粉平均粒径小于14μm的超微绿茶粉，所得超微绿茶粉在30～50℃下干燥后备用；
步骤2b，称取一定质量炒青绿茶，溶于40～60％v/v乙醇，料液比为1:15～30，水浴加热提取茶多酚粗品，40～60℃干燥后备用；
步骤3b，按质量份数，取1～5份的超微绿茶粉、1～5份的茶多酚粗品和2～8份的咖啡碱加10-50份的水混合；水浴加热后微孔滤膜过滤除菌，冷却后即获得绿茶抑菌剂。
优选的，混合后在80℃下水浴加热15～30分钟再微孔滤膜过滤除菌。
优选的，所述的炒青绿茶采用工业生产产生的炒青绿茶渣。
优选的，步骤1中，恒温恒湿下平衡的条件为：在18～28℃的温度和40～70％的相对湿度下平衡36-48h。
优选的，步骤1中，超微粉碎时，以氧化锆为球磨介质在4～15℃下超微粉碎1-2h。
一种由权利要求1-9任意一项所述的制备方法得到的抑制青枯菌增殖的绿茶抑菌剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：
本发明所述的制备方法直接利用茶叶深加工的产品作为抑菌配方，通过低温超微粉碎制备茶粉比表面积明显增加，大量释放有效活性成分；超微粉体的特殊性质，如表面效应、体积效应、量子效应、隧道效应等使其具有良好的吸收性和分散性，可提高有效成分的活性和生物利用度；超微粉碎是纯物理过程，加工中不加入化学试剂，保持加工产品的纯天然性；通过以超微绿茶粉作土传病害青枯菌抑菌剂，能够成为绿色农药研究开发新产品的发展方向。制备工艺简单、原料来源丰富，生产成本较低，不受资源限制，环境污染小，可大量生产且产品对人体和作物都很安全。
进一步的，通过增加特定的绿茶有效活性成分，通过溶液直接混合定容或是粉体混合后水浴加热，提高有效成分的释放和溶解协同，更好的提高了抑菌剂对青枯菌的作用效果。
本发明所述的绿茶抑菌剂，是绿茶通过低温超微粉碎后呈微粉形态，增大分散性和有效成分溶出，其活性成分如茶多酚、茶氨酸、咖啡碱、维生素c等活性物质能够抑制青枯菌在土壤中增殖，而且茶叶中的微量元素如硒、锌等经过超微粉碎，充分溶出，进而溶于土壤中，增加土壤营养。
附图说明
图1为本发明所述超微绿茶粉的扫描电镜图sem。
图2为本发明实例中所述绿茶抑菌剂体外模拟试验结果对比图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明将超微绿茶粉溶于超纯水中制得一定浓度(1％～10％w/v)的绿茶粉抑菌剂，灌溉于茄科农作物根部可明显抑制青枯菌生长。本发明模拟了超微绿茶粉体外抑菌试验，如图2所示，青枯菌在含不同比例绿茶抑菌剂培养液中培养12h后生长情况，结果证明一定浓度(1％～5％w/v)的绿茶粉抑菌剂对青枯菌增殖有明显抑制作用。超微绿茶粉作为一种绿色农药，能自行分解，无毒性残留，对人体无害，使用安全，且绿茶中的多种营养物质和微量元素如硒、锌充分融入到土壤中，增加土壤营养，在农药行业具有广泛应用前景。其中所述的超微绿茶粉能够采用下述各实施例中的制备方法得到。
其中，如图1所示，超微绿茶粉平均粒径小于14μm，使茶叶中多种营养成分如茶多酚、茶氨酸、硒等充分释放。本优选实例中，将工业生产遗弃的绿茶渣(炒青)为原料，低温超微粉碎得到超微绿茶粉。
本发明制备的绿茶抑菌剂灌溉到土壤中能自行分解，无毒性残留，对人体无害，使用安全，且绿茶中的多种营养物质和微量元素如硒、锌充分融入到土壤中，既增加土壤营养，又能有效抑制土传病害青枯菌在作物根系增殖。
具体的如以下实施例所述。
实施例1
一种抑制青枯菌增殖的绿茶抑菌剂的制备方法，包括如下步骤：
第一：以炒青绿茶为原料，恒温恒湿(22℃，rh＝60％)下平衡36～48h。以氧化锆为球磨介质在4℃下超微粉碎1h，室温下过2000目筛，茶粉平均粒径小于14μm，所得超微绿茶粉30℃干燥备用。优选的，能够采用以工业生产的炒青绿茶渣为原料，不仅成本低廉，而且操作简单实用。
第二：称取一定质量绿茶渣，溶于50％(v/v)乙醇，料液比为1:15，80℃水浴加热30分钟提取茶多酚粗品，45℃干燥后，置于4℃冰箱保存备用。
第三：按照一定比例配制绿茶抑菌剂，依次添加超微绿茶粉1％(w/v)溶于甲醇中，再分别添加茶多酚粗品1％(w/v)和咖啡碱3％(w/v)在40℃下充分混合，加入甲醇体积3倍的水定容。即获得绿茶抑菌剂。
本发明制备的绿茶抑菌剂灌溉到土壤中能自行分解，无毒性残留，对人体无害，使用安全，且绿茶中的多种营养物质和微量元素如硒、锌充分融入到土壤中，既增加土壤营养，又能有效抑制土传病害青枯菌在作物根系增殖。
实施例2
一种抑制青枯菌增殖的绿茶抑菌剂的制备方法，包括如下步骤：
第一：以工业生产绿茶渣(炒青)为原料，恒温恒湿(18℃，rh＝40％)下平衡36～48h。以氧化锆为球磨介质在2℃下超微粉碎2h，室温下过2000目筛，茶粉平均粒径小于14μm，所得超微绿茶粉45℃干燥备用。
第二：称取一定质量绿茶渣，溶于40％(v/v)乙醇，料液比为1:20，80℃水浴加热30分钟提取茶多酚粗品，40℃干燥后，置于4℃冰箱保存备用。
第三：按照一定比例配制绿茶抑菌剂，依次添加超微绿茶粉3％(w/v)溶于甲醇中，再分别添加茶多酚粗品3％(w/v)和咖啡碱2％(w/v)在60℃下充分混合，加入甲醇体积4倍的水定容。即获得绿茶抑菌剂。
本发明制备的绿茶抑菌剂灌溉到土壤中能自行分解，无毒性残留，对人体无害，使用安全，且绿茶中的多种营养物质和微量元素如硒、锌充分融入到土壤中，既增加土壤营养，又能有效抑制土传病害青枯菌在作物根系增殖。
实施例3
一种抑制青枯菌增殖的绿茶抑菌剂的制备方法，包括如下步骤：
第一：以工业生产绿茶渣(炒青)为原料，恒温恒湿(28℃，rh＝70％)下平衡36～48h。以氧化锆为球磨介质在15℃下超微粉碎3h，室温下过2000目筛，茶粉平均粒径小于14μm，所得超微绿茶粉50℃干燥备用。
第二：称取一定质量绿茶渣，溶于60％(v/v)乙醇，料液比为1:25，80℃水浴加热30分钟提取茶多酚粗品，50℃干燥后，置于4℃冰箱保存备用。
第三：按照一定比例配制绿茶抑菌剂，依次添加超微绿茶粉5％(w/v)溶于甲醇中，再分别添加茶多酚粗品5％(w/v)和咖啡碱5％(w/v)在80℃下充分混合，加入甲醇体积5倍的水定容。即获得绿茶抑菌剂。
本发明制备的绿茶抑菌剂灌溉到土壤中能自行分解，无毒性残留，对人体无害，使用安全，且绿茶中的多种营养物质和微量元素如硒、锌充分融入到土壤中，既增加土壤营养，又能有效抑制土传病害青枯菌在作物根系增殖。
实施例4
一种抑制青枯菌增殖的绿茶抑菌剂的制备方法，包括如下步骤：
第一：以工业生产绿茶渣(炒青)为原料，恒温恒湿(25℃，rh＝50％)下平衡36～48h。以氧化锆为球磨介质在20℃下超微粉碎3h，室温下过2000目筛，茶粉平均粒径小于14μm，所得超微绿茶粉40℃干燥备用。
第二：称取一定质量绿茶渣，溶于50％(v/v)乙醇，料液比为1:30，80℃水浴加热30分钟提取茶多酚粗品，60℃干燥后，置于4℃冰箱保存备用。
第三：按照一定比例配制绿茶抑菌剂，依次添加超微绿茶粉4％(w/v)溶于甲醇中，再分别添加茶多酚粗品4％(w/v)和咖啡碱8％(w/v)在80℃下充分混合，加入甲醇体积3倍的水定容。即获得绿茶抑菌剂。
实施例5
将实施例1-4中任意一个方法中的第一步得到的超微绿茶粉，按照比例1％(w/v)加入蒸馏水配成绿茶溶液，80℃水浴加热20分钟，静置沉淀5h，用一次性针头吸取上清液，真空抽滤，所得滤液为绿茶抑菌剂，置于4℃冰箱保存备用，能够直接使用。
实施例6
将实施例1-4中任意一个方法中的第一步得到的超微绿茶粉，按照比例3％(w/v)加入蒸馏水配成绿茶溶液，70℃水浴加热30分钟，静置沉淀3h,用一次性针头吸取上清液30ml,真空抽滤，所得滤液为绿茶抑菌剂，置于4℃冰箱保存备用。
实施例7
将实施例1-4中任意一个方法中的第一步得到的超微绿茶粉，按照比例5％(w/v)加入蒸馏水配成绿茶溶液，90℃水浴加热50分钟，静置沉淀6h,用一次性针头吸取上清液50ml,真空抽滤，所得滤液为绿茶抑菌剂，置于4℃冰箱保存备用。
实施例8
在实施例5-7中的绿茶抑菌剂中，加入咖啡碱，咖啡碱和超微绿茶粉的质量比为2:1。超微绿茶粉的量为制备绿茶抑菌剂时，配成绿茶溶液时加入的超微绿茶粉的量。
实施例9
在实施例5-7中的绿茶抑菌剂中，加入咖啡碱，咖啡碱和超微绿茶粉的质量比为2:5。
实施例10
在实施例5-7中的绿茶抑菌剂中，加入咖啡碱，咖啡碱和超微绿茶粉的质量比为8:1。
实施例11
在实施例5-7中的绿茶抑菌剂中，加入咖啡碱，咖啡碱和超微绿茶粉的质量比为8:5。
实施例12
在实施例5-7中的绿茶抑菌剂中，加入咖啡碱，咖啡碱和超微绿茶粉的质量比为3:5。
实施例13
在实施例5-7中的绿茶抑菌剂中，加入咖啡碱，咖啡碱和超微绿茶粉的质量比为3:1。
实施例14
在实施例1-4中任意一个方法中的第三步替换如下步骤。
按质量份数，取1份的超微绿茶粉、1份的茶多酚粗品和2份的咖啡碱加10份的水混合；水浴加热后微孔滤膜过滤除菌，冷却后即获得绿茶抑菌剂。优选的，微孔滤膜的滤径为0.45μm。
实施例15
在实施例1-4中任意一个方法中的第三步替换如下步骤。
按质量份数，取3份的超微绿茶粉、3份的茶多酚粗品和3份的咖啡碱加30份的水混合；水浴加热后微孔滤膜过滤除菌，冷却后即获得绿茶抑菌剂。优选的，微孔滤膜的滤径为0.45μm。
实施例16
在实施例1-4中任意一个方法中的第三步替换如下步骤。
按质量份数，取5份的超微绿茶粉、5份的茶多酚粗品和8份的咖啡碱加50份的水混合；水浴加热后微孔滤膜过滤除菌，冷却后即获得绿茶抑菌剂。优选的，微孔滤膜的滤径为0.45μm。
实施例16
在实施例1-4中任意一个方法中的第三步替换如下步骤。
按质量份数，取2份的超微绿茶粉、4份的茶多酚粗品和5份的咖啡碱加40份的水混合；水浴加热后微孔滤膜过滤除菌，冷却后即获得绿茶抑菌剂。优选的，微孔滤膜的滤径为0.45μm。
实施例17
在实施例1-4中任意一个方法中的第三步替换如下步骤。
按质量份数，取4份的超微绿茶粉、2份的茶多酚粗品和6份的咖啡碱加20份的水混合；水浴加热后微孔滤膜过滤除菌，冷却后即获得绿茶抑菌剂。优选的，微孔滤膜的滤径为0.45μm。
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制，所述实施方案只作为阐明本发明各方面的单个例子，本发明范围还包括功能等同的方法和组分。本领域技术人员在没有脱离权利要求限定范围的前提下，仍然可以对本发明做出各种改进和变换，所做的改进和变换仍然属于本发明的保护范围。
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