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用于维生素检测的突变体和包含该突变体的生物传感器及其构建方法和应用

泰然健康网
2025-08-29 02:48

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种用于维生素检测的突变体和包含该突变体的生物传感器及其构建方法和应用。

背景技术：

1、维生素bt又名左旋肉碱(l-carnitine)，是一种类氨基酸，与d-肉碱互为同分异构体。维生素bt广泛存在于人体和多种食物中，如红肉、奶制品等。维生素bt在真核生物的中间代谢中扮演着关键角色，参与中长链脂肪酸的β-氧化过程以及线粒体中酰基和乙酰基与辅酶a(coa)的交换，对于能量的产生和脂肪酸的代谢至关重要。因此，左旋肉碱在医疗、保健和动物养殖业中得到了广泛的应用。

2、左旋肉碱的生产工艺包括天然动物提取法、生物合成法和化学合成法，在工业化生产中主要依赖化学合成方法，但化学合成过程通常需要使用有害的化学物质，这些物质在生产过程中可能会对环境造成污染，还可能会对工人的呼吸系统、皮肤和眼睛造成刺激，甚至引起更严重的健康问题。

3、与化学合成方法相比，生物法生产左旋肉碱是一种更为环保和可持续的方法，生物法生产过程中使用的原料更安全，产生的废物更少，对环境的影响也更小，作为一种高效、绿色的方法，在工业生产中具有巨大的潜力，尤其是在生物合成领域。

4、在左旋肉碱的生物合成过程中，生物传感器在高通量大规模筛选条件下的优势显著，特别是在高产菌株的筛选及关键限速酶的改造方面，通过生物传感器，可以快速、准确地识别和选择能够高效生产左旋肉碱的微生物菌株，从而优化生产过程。左旋肉碱生物传感器的构建依赖转录因子caif，因此对caif关键结合位点的鉴定不仅有助于理解其调控机制，还能为设计更高效的生物传感器提供分子基础。

5、此外，开发一个扩大响应范围的左旋肉碱生物传感器对于工业生产具有重要应用价值，这样的传感器能够提高筛选效率，识别出在更高浓度下产生左旋肉碱的菌株，从而加速生产过程并降低成本。这种改造不仅能够提升生物传感器在基础研究中的应用，还能推动其在生物制药、食品工业和环境监测等领域的商业化进程。

6、综上所述，目前，迫切需要开发一种用于维生素检测的生物传感器，提高其响应强度和扩宽其检测范围，以满足对左旋肉碱高通量、快速检测的需求，这将有助于进一步推动左旋肉碱的生物合成技术，使其在多个领域中获得更大的应用。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种用于维生素检测的突变体；

2、本发明的另一个目的是提供一种含有用于维生素检测突变体的生物传感器及其构建方法和应用。

3、caif基因作为维生素bt合成途径中的正调控子，虽然caif基因不直接参与维生素bt的检测过程，但它可以通过影响发酵液中维生素bt的浓度和摩尔转化率等关键指标，间接影响维生素bt的筛选，优化caif基因的表达不仅有助于提升维生素bt的生产效率，还能加速高产菌株的筛选进程，从而提高整个检测和筛选过程的效率和准确性。

4、本发明所要解决的技术问题是构建响应强度提高、检测范围更宽的左旋肉碱生物传感器，以满足对左旋肉碱高通量、快速检测的需求。

5、在本技术中提供一种用于维生素检测的突变体，所述用于维生素检测的突变体即为caif蛋白突变体，所述caif蛋白突变体的基因是由原始蛋白caif进行定点突变，经过一个丙氨酸取代获得，所述取代为选自r131a、r91a、q119a、s31a、e67a、e84a中的一个，并构建突变体库；

6、所述原始蛋白caif的氨基酸序列为seq id no.1，seq id no.1为：

7、mcegyvekplylliaewmmaenrwviareisihfdiehskavntltyilse vteiscevkmipnklegrgcqcqrlvkvvdideqiyarlrnnsreklvgvrkt pripavpltelnreqkwqmmlsksmrr。

8、在本技术中提供一种用于维生素检测的生物传感器，所述生物传感器中包含如上所述的caif蛋白突变体基因结合位点；

9、具体地，所述生物传感器含有启动子pfix,caic基因，用于维生素检测的caif蛋白突变体基因结合位点及编码标记物的基因；

10、进一步地，所述pfix上整合调控caif蛋白突变体基因结合位点的序列，并调控编码标记物的基因表达；编码所述蛋白caif的氨基酸序列如seq id no.1所示，seq id no.1为：

11、mcegyvekplylliaewmmaenrwviareisihfdiehskavntltyilse vteiscevkmipnklegrgcqcqrlvkvvdideqiyarlrnnsreklvgvrkt pripavpltelnreqkwqmmlsksmrr；

12、进一步地，caif蛋白突变体和编码标记物基因位于质粒载体上，即所述生物传感器是质粒；

13、进一步地，所述质粒载体包括但不限于pbbr系列质粒；

14、进一步地，所述质粒载体为pbbr-caicm；

15、进一步地，所述编码标记物为荧光蛋白编码基因；

16、进一步地，所述编码标记物为绿色荧光蛋白编码基因；

17、进一步地，所述编码标记物为绿色荧光蛋白编码基因sfgfp，所述绿色荧光蛋白编码基因sfgfp的氨基酸序列为seq id no.2，seq id no.2为：seq id no.2为：

18、mskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvrgegegdatngkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkrhdffksampegyvqertisfkddgtyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynfnshnvyitadkqkngikanfkirhnvedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsvlskdpnekrdhmvllefvtaagithgmdelyk。

19、在此基础上，在本技术中进一步提供一种生物传感器的构建方法，具体包括以下步骤：

20、(1)对caif蛋白突变体进行环氏pcr，克隆到载体pbbr-caicm上，构建质粒突变库；

21、所述caif蛋白突变体包括由原始蛋白caif经过一个丙氨酸取代获得，所述取代分别选自r131a、r91a、q119a、s31a、e67a、e84a，并构建所述质粒突变库；

22、(2)将突变质粒导入大肠杆菌dh5α中，涂板，使用固体培养基进行培养；

23、(3)对固体培养基上的单菌落进行验证，验证正确后，进行质粒提取；

24、(4)将生物传感器的突变质粒导入感受态bw25113(de3)δcaia中，验证正确后，挑取单菌落于5ml含有安普霉素的lb试管中，37℃，200rpm过夜培养；(5)按1％比例转接至含有0.8ml m9培养基的96孔板中，培养20h测定荧光强度(afu)和600nm处的吸光度(od)；该m9培养基中含有安普霉素和不同浓度的左旋肉碱。

25、本技术还包括含有上述生物传感器的基因工程菌株；

26、本技术还包括上述生物传感器在筛选维生素菌株中的应用。

27、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

28、通过定点突变对caif蛋白进行改造，构建携带caif蛋白突变体的生物传感器，该生物传感器中包括了一个丰富的质粒突变库，显著拓宽了生物传感器的检测边界，使其能够迅速且便捷的在微生物群体中高效筛选出左旋肉碱高产菌株，针对特定代谢物高效生产菌株的快速识别与利用上，具有显著的进步：不仅为左旋肉碱的工业化生产提供了强有力的工具，也为其他生物活性物质的微生物筛选开辟了新的途径。