一种催化合成左旋肉碱的生物酶及其制备方法与流程
本发明涉及一种合成左旋肉碱的方法，尤其是采用高效的生物酶催化和现代化的分离技术的左旋肉碱合成方法，具体是一种催化合成左旋肉碱的生物酶及其制备方法。
背景技术：
左旋肉碱(l-carnitine)，又称l-肉碱或音译卡尼丁，是一种促使脂肪转化为能量的类氨基酸，红色肉类是左旋肉碱的主要来源，对人体无毒副作用。左旋肉碱是脂肪代谢过程中的一种关键的物质，能够促进脂肪酸进入线粒体氧化分解。左旋肉碱的主要生理功能是促进脂肪转化成能量，服用左旋肉碱能够在减少身体脂肪、降低体重的同时，不减少水分和肌肉，在2003年被国际肥胖健康组织认定为最安全无副作用的减肥营养补充品。
左旋肉碱的制取方法
1.直接提取法
由以上表可以看出．在动物肌肉中左旋肉碱的含量相对较丰富，早期的左旋肉碱往往是从肉浸汁中分离出来但由于左旋肉碱的绝对含量较少，且有结构类似物(肉浸汁中的胆碱)存在，难以分离，因而提取纯化的步骤较多，收率低，不适合工业化生产。
2．消旋体拆分法
化学拆分
美国专利3151149报道了使用d-(+)-樟脑-10-磺酸进行拆分，但此方法要使用agno3以除去cl-，因而成本高，收率低(小于50％)，纯度低，生产条件苛刻。左旋肉碱比较经典的化学拆分法是先合成肉碱消旋体然后再进行拆分。以环氧氯丙烷为起始原料，经胺化、腈化、水解而得到肉碱消旋体。此法的优点是避开了有毒的氰化物等有毒物质，且无需离子交换树脂，操作简单安全，但合成步骤多、收率不高。
生物拆分
利用微生物专一降解右旋肉碱的能力生产左旋肉碱。charles在此方面作了很多工作．选育出降解右旋肉碱有特效的菌株，经过25℃，44h的培养，右旋肉碱全部消失，左旋肉碱剩下38%，由此可见，尽管纯度很高，但收率太低。
3．不对称催化合成法
用催化剂的不对称中心来诱导产生物的手性。这是指只合成光学异构体中的一个方法。kitamura等人通过不对称催化氢化γ一氯一乙酰乙酸酯合成出制各左旋肉碱的重要中间体γ-氯-β-羟基丁酸酯。反应得到中间体的光学纯度为97%，这种方法简便。快捷，纯度高，但反应条件苛刻。mccarthy发明了一种简单的方法，就是以(s)-3-羟基丁酸内酯为原料，经过两步反应，直接得到左旋肉碱，光学纯度高达95%。
4．生物化学法。
技术实现要素：
发明目的：为了解决以上问题，本发明的第一个目的在于提供一种催化合成l-左旋肉碱的生物酶。
本发明的第二个目的是提供一种编码所述催化合成左旋肉碱的生物酶的核苷酸序列。
本发明的第三个目的是提供一种催化合成左旋肉碱的生物酶的发酵方法。
本发明的第四个目的是提供从发酵液中制备催化合成l-左旋肉碱的生物酶的提取方法。
技术方案：本发明的技术方案如下：
一种催化合成左旋肉碱的生物酶，所述生物酶为seqidno：2所示的氨基酸序列。
根据本发明所述催化合成左旋肉碱的生物酶，所述生物酶来源于体外重组构建的基因工程菌株。
根据本发明所述催化合成左旋肉碱的生物酶，所述基因工程菌株为大肠杆菌、毕氏酵母、枯草芽孢杆菌。
本发明还提供一种编码所述的催化合成左旋肉碱的生物酶的核苷酸序列，所述核苷酸序列如seqidno：1所示。
本发明还提供一种所述的催化合成左旋肉碱的生物酶的制备方法，包括如下步骤：
（1）首先构建l-左旋肉碱的基因工程菌株，将权利要求3所述的核苷酸序列经酶切重组到表达载体，转化到宿主细胞中；
（2）将阳性克隆挑入lb液体培养基活化后转接入lb液体培养基中，培养，经发酵，得到含有催化合成l-左旋肉碱的生物酶。
本发明所述的催化合成左旋肉碱的生物酶提取方法，包括如下步骤：
（1）取原种菌种在斜面培养基划线，37℃，倒置培养16h。
（2）在斜面上挑取2环菌种至5ml种子培养基（50ml试管）中，37℃，200rpm振荡培养14小时，制备一级种子液。
（3）试管菌种转接至200ml培养基（500酶量三角瓶）中，37℃，200rpm振荡培养8小时，制备二级种子液。
（4）以5%的接种量接种到30l发酵培养基中（50l发酵罐），ph7.0±02，温度37±0.5℃，通气、搅拌、补糖、培养，通过iptg诱导16-18h，高速离心，收集菌体细胞。
（5）发酵液降温至0-4℃，管式离心机高速离心，收集菌泥。
（6）菌泥冻干制酶制剂冻干粉。
有益的效果：本发明提供的l-左旋肉碱的生物合成采用生物酶法催化两步合成l-左旋肉碱；本发明提供的酶同时包含催化合成使用的辅酶（nad和nadh，而且形成内循环），无需另外补加，大大降低生产成本，并采用现代化的先进分离技术，使l-左旋肉碱的工业化生产确实有效实行。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本发明所应用：
lb培养基配方：10g蛋白胨，5g酵母粉，10gnacl，；加蒸馏水完全溶解后定容至1000ml，高压灭菌；
lb固体培养基：lb培养基补充加入0.8%琼脂，高压灭菌；
m9培养基：12.8gna2po4·7h2o、3.0gkh2po4、0.5gnacl、1.0gnh4cl加双蒸水1000ml溶解，121度灭菌15分钟，
m9调整培养基：1000mlm9培养基补充加入1m的mgso42ml，20%的葡萄糖溶液20ml，1m的cacl20.1ml，蛋白胨10g，酵母粉5g。
氨苄青霉素母液：5g氨苄青霉素溶于双蒸水，定容至1000ml，用0.22μ过滤器除菌；
iptg母液：20giptg溶于双蒸水，定容至1000ml，用0.22μ过滤器除菌；
斜面培养基：蛋白胨1%，酵母浸出物0.5%，氯化钠1%，琼脂2%，淀粉1%，ph自然。
种子培养基：蛋白胨1%，酵母浸出物0.5%，氯化钠1%，ph值自然。
发酵培养基：调整后的m9培养基。
补料培养基：60%葡萄糖，ph值自然
实施例1：生物酶的基因工程菌株构建
将全基因合成的生物酶片段（序列如seqidno：1所示），经限制性内切酶，在双酶切位点ndei和hindiii，重组到pet21a（＋）（购于navogen公司），并转入bl21(de3)感受态细胞(购于天根生化科技(北京)有限公司)，获得表达蛋白酶及辅酶的基因工程菌，该菌株命名为dhkr-pet21a。
实施例2：生物酶的发酵
取原种菌种dhkr-pet21a在斜面培养基划线，37℃，倒置培养16h。在斜面上挑取2环菌种至5ml种子培养基（50ml试管）中，37℃，200rpm振荡培养14小时，试管菌种转接至200ml培养基（500酶量三角瓶）中，37℃，200rpm振荡培养8小时，制备二级种子液，od600=3-4制备种子液。将发酵培养基按每升料配置好后，转移至50l发酵罐中，121℃灭菌30min；降温后控制温度为37℃，加入50mg/ml的氨苄青霉素母液12-120ml。以5%的接种量，将培养好的二级菌种接种至30l发酵培养基中（50l发酵罐），温度37±0.5℃，ph7.0±0.5，转速200-500rpm/min，通气量30-60l/min，以210-600ml/h的速度补加60%的葡萄糖溶液，培养至发酵液od至达到34-37，补加15-75mliptg母液，1h时间降温至32±05℃，诱导16-18h，得到含左旋肉碱合成酶及辅酶的发酵液。
实施例3：生物酶的提取
发酵液降温至0-4℃，使用管式离心机高速离心，将液体全部清除，收集没有流动态的菌泥，真空冷冻干燥获得酶制剂。
实施例4：生物酶催化合成左旋肉碱
工艺以4-氯乙酰乙酸乙酯为原料，经过生物酶催化合成
向水中添加4-氯乙酰乙酸乙酯和异丙醇，调节反应体系ph至7.0±0.5，温度25-30℃，加入生物酶制剂催化合成反应24h，反应液通过减压蒸馏，收集冷凝液获得不含无法后处理杂质的4-氯-3羟基-丁酸乙酯，添加三甲胺和naoh反应生成左旋肉碱
本说明书描述了一些实施方式，然而应理解，本领域技术人员通过阅读本说明书可获知不背离本发明的构思和范围的各种改进。因此，这些其他实施方式也应当包括在所附权利要求书范围内。
序列表
seqidno：1
atgacaaaagacaatattgattctgttgattcagctaagaatttctgtactgtttcaggaagaccgctagttattggaactggtactggtaccaaatggcaatggctcaagaagggtagaccgattgaagaaagaaataagccaatccaagagttgattgaccaattgttgttagctttgaataatggctactatcacattgatactgccgaaatttatacaactcatcccgaagtcgcagaagctgtgaagcaaagcggtattaagagagaggatttatggattaccagtaagtataacccataccgtcaggtcactgcagccgaagctatcaaatcgacattagcagagttacagactgattatcttgatttatacttgattcacgcacctttttttgaggatgaagcttcctatagtattgagatggcttggaaagagataattgaggccaagaagcagggaaaaattagatatatcggagtttcaaacttttcgatacctaatttggagagaattttcaaggcatttgaaccggagttttatcctgtggtaaaccaaattgaattccacgcctacttacaaaatcaaagtgccggtattactgattattgcaaaaagcgcaacattcttctcgaagcctatgctcctttgacaccattattcagaattcaatcaggtgaagctgataccgaaggagatccgttgagaaaaatcttaccagctttgagcgacaagtaccagaaaacagattcgcaaatcttgttaagatatgctttacaaaaaggatatttaccaattactacatcttccaaggttcaaagaattagagagaccttggctatttacgagtttgaattatctgccgacgatgttgctttgattgacaaacagggttcaacctttcactttagaagctttttcaattcgaattttgactaa
seqidno：2
mtkdnidsvdsaknfctvsgrplvigtgtgtkwqwlkkgrpieernkpiqelidqlllalnngyyhidtaeiytthpevaeavkqsgikredlwitskynpyrqvtaaeaikstlaelqtdyldlylihapffedeasysiemawkeiieakkqgkiryigvsnfsipnlerifkafepefypvvnqiefhaylqnqsagitdyckkrnilleayapltplfriqsgeadtegdplrkilpalsdkyqktdsqillryalqkgylpittsskvqriretlaiyefelsaddvalidkqgstfhfrsffnsnfd
相关知识
产左旋肉碱的重组菌及其构建方法与应用与流程
一种茶提取液及其制备方法与流程
左旋肉碱的生理功能
一种肉鸡茶叶渣菌酶协同发酵饲料及其制备方法与流程
一种酶法合成中国母乳甘油三酯替代品的制备方法及用途与流程
【左旋肉碱】左旋肉碱
多层复合蛋白棒及其制备方法与流程
一种有机综合果蔬提取物及其制备方法与流程
食品营养强化剂左旋肉碱的生理功能及应用
左旋肉碱知识普及
网址: 一种催化合成左旋肉碱的生物酶及其制备方法与流程 https://m.trfsz.com/newsview877954.html
